Nouvelle réponse à la norme - NY / t 4630 - 2025 détermination de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline dans le lait de vache et ses produits

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Date :2025-05-27Lire :0

Introduction

Le lait cru de vache est riche en plusieurs protéines actives naturelles telles que l'alpha - lactalbumine (Alpha lactalbumine), la bêta - lactoglobuline (bêta lactoglobuline), la Lactoferrine (Lactoferrine, LF), l'immunoglobuline G (immunoglobuline G, IgG) et la lactoperoxydase (Lactoperoxidase, LP), entre autres, qui jouent un rôle important dans la lutte contre les bactéries, les invasions virales, le renforcement de l'immunité, la réparation des tissus et la croissance et le développement. Où l'alpha - lactalbumine a des effets anticancéreux, antibactériens et antiviraux, régule la fonction immunitaire, favorise la synthèse du lactose et la sécrétion de lait; La bêta - lactoglobuline a une activité hypocholestérolémiante, antioxydante et antivirale qui favorise l'absorption digestive des vitamines liposolubles. Différents traitements thermiques (pasteurisation, stérilisation à ultra haute température (UHT), concentration par évaporation et séchage par atomisation, etc.) peuvent entraîner différents degrés d'inactivation dénaturante de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline dans les produits laitiers, ce qui affecte leur valeur nutritionnelle et leur prix de vente sur le marché.

Faits saillants de la nouvelle réponse d'étiquetage de symerfly

1.Cet essai fait référence à NY / t 4630 - 2025 et aux normes de groupe et d'entreprise pertinentes pour déterminer la teneur en alpha - lactalbumine et en bêta - lactoglobuline du lait pasteurisé, du lait ultra - pasteurisé et des préparations pour nourrissons et jeunes enfants.NY / t 4630 - 2025 sera officiellement mis en œuvre le 1er mai 2025- Oui.

2. Cet essai utilise une colonne chromatographique accucore 150 C4 de particules nucléaires solides de granulométrie 2,6 µm couplée à un débit inférieur (0,8 mL/min), plus petit volume d'échantillon (10 μL), et une fréquence d'échantillonnage plus élevée (10 Hz), de sorte que les pics et les degrés de séparation de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline sont dus à la norme.

3. Pour obtenir une bonne forme de crête et un bon degré de séparation, les essais ont été correctement optimisés pour le traitement préalable à l'échantillon et les conditions de chromatographie liquide en éluant avec un gradient de 0,1% trifluoroacétate d'eau - 0,1% trifluoroacétate d'acétonitrile comme phase mobile à une température de colonne de 60°C et un débit de 0,8 ml / min, la pression maximale du système ne dépassant pas110 bar- Oui.

4. Les résultats de l'essai ont montré que: l'alpha - lactalbumine et la bêta - lactoglobuline ont un bon pic chromatographique, une excellente efficacité de la colonne et un excellent degré de séparation,La séparation du pic principal de l'alpha - lactalbumine des pics interférents voisins est significativement meilleure que le spectrogramme standard. solution standard mixte d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (100 µg / ML), temps de rétention de l'alpha - lactalbumine de 21900 min, facteur d'asymétrie de 0,98, nombre de plateaux théoriques 321 137; Temps de rétention de la bêta - lactoglobuline b 24747 min, facteur d'asymétrie 1,01, nombre de plateaux théoriques 352 451; Temps de rétention de la bêta - lactoglobuline a de 25467 min, facteur d'asymétrie 1,00, nombre théorique de plateaux 373 359; L'alpha - lactalbumine est séparée de la bêta - lactoglobuline B par un degré de séparation de 17,77 et la bêta - lactoglobuline B par un degré de séparation de 4,33; Quatre prélèvements successifs avec un temps de rétention et un RSD de l'aire du pic inférieurs à 0,3%, une bonne reproductibilité de la méthode; Gamme linéaire de solutions standard d'alpha - lactalbumine 0,00 - 200 μg / ML, coefficient de corrélation linéaire r²≥ 09997, gamme linéaire de solutions standard de bêta - lactoglobuline 0,00 - 200 μg / ML, coefficient de corrélation linéaire r²≥ 09991, bonne linéarité.

5. Dans un test de détermination de la teneur en alpha - lactalbumine versus bêta - lactoglobuline dans des produits laitiers par chromatographie liquide en phase inverse,Accucore 150 C4La colonne de chromatographie, associée au système de chromatographie liquide haute performance Vanquish Core, a montré une bonne reproductibilité et une excellente stabilité, les limites de détection et de quantification de la méthode répondant aux exigences standard et pouvant être utilisées par les entreprises laitières et les laboratoires d'essais alimentaires.

6.Références connexes dans le test de détermination de la teneur en alpha - lactalbumine versus bêta - lactoglobuline dans les produits laitiers par chromatographie par perméation de gel, deux bâtonnets sont utilisés en tandemMAbPac SEC-1 (300 Å, 5 μm, 7,8 x 300 mm)Une colonne de chromatographie d'exclusion volumique en élution isocratique avec du chlorhydrate de Guanidine 6 m en phase mobile permet de séparer efficacement l'alpha - lactalbumine et la bêta - lactoglobuline à 280 nm.

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NY/T 4630-2025

Symerfly solutions d'application complètes

Traitement avant échantillon

1.1 Échantillon liquide: lait cryogénique (lait cru de vache, lait pasteurisé) / lait normal (lait stérilisé à ultra haute température (UHT))

Peser l'échantillon de 5 G (exactement à 0,1 mg) dans un tube à centrifuger gradué à couvercle rotatif de 50 ml, ajouter une quantité appropriée d'eau pour mélanger au Vortex pendant 30 s, ajuster le pH à 4,60 ± 0,05 avec une quantité appropriée d'acide acétique, après avoir été conditionné à 25,0 ML avec de l'eau, mélanger au Vortex pendant 1 min, laisser reposer pendant plus de 30 min, centrifuger à 4 ℃ à 12 000 tr / min pendant 15 min. Le surnageant (qui peut être dilué avec de l'eau ultra - pure, le cas échéant) est prélevé sur une membrane de filtration microporeuse en PTFE hydrophile de 0,2 µm (P / N: 42213 - NPL) et le filtrat est soumis à un essai en machine.

1.2 Échantillons solides: lait en poudre (préparations pour nourrissons et jeunes enfants)

Peser l'échantillon de 2 G (exactement à 0,1 mg) dans un tube à centrifuger gradué de 50 ml avec couvercle rotatif, ajouter une quantité appropriée d'eau et mélanger au Vortex pendant 1 min pour le rendre suffisamment soluble (si nécessaire, l'eau chaude peut être baignée ouverte), après ajustement du pH à 4,60 ± 0,05 avec une quantité appropriée d'acide acétique, ajuster avec de l'eau à 25,0 ML, mélanger au Vortex pendant 1 min, laisser reposer plus de 30 min, centrifuger à 12000 RPM 4 ℃ pendant 15 min. Le surnageant (qui peut être dilué avec de l'eau ultra - pure, le cas échéant) est prélevé sur une membrane de filtration microporeuse en PTFE hydrophile de 0,2 µm (P / N: 42213 - NPL) et le filtrat est soumis à un essai en machine.

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Configuration de l'instrument et conditions chromatographiques

Thermo Scientific ™ Vanquish Core ™ Système de chromatographie liquide à haute performance, configuration: pompe Quaternary Pump C (VC - p20 - a), échantillonneur automatique Split Sampler CT (VC - A12 - a), thermostat colonne column Compartment C (VC - C10 - a), détecteur Diode Array Detector CG (VC - d11 - a), traitement de données chromeleon ™ 7.3

Colonne chromatographique: accucore 150 C4, 2,6 µm, 4,6 x 150 mm (P / N: 16526 - 154630)

Phase mobile: A: 0,1% trifluoroacétate d'eau B: 0,1% trifluoroacétate d'acétonitrile

Débit:0.8mL/min

Procédure d'élution en gradient:

Quantité d'échantillon:10µL

Température de la colonne: 60 ℃

Détecteur: Dad, longueur d'onde d'acquisition: 210 nm; fréquence d'acquisition:10Hz; acquisition spectrale: 190 - 400 nm

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Cartes spectrales et données

3.1 spectrogrammes de séparation et données pour les solutions standard mixtes d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline

Figure 1 spectrogramme d'isolement et données de la solution standard mixte d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (100 µg / ML)(cliquez pour l'agrandir)

Comme le montre la figure 1, les pics chromatographiques de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline sont bons, l'efficacité de la colonne est excellente et le degré de séparation est supérieur à la norme. Temps de rétention de l'alpha - lactalbumine de 21900 min, facteur d'asymétrie de 0,98, nombre de plateaux théoriques 321 137; Temps de rétention de la bêta - lactoglobuline b 24747 min, facteur d'asymétrie 1,01, nombre de plateaux théoriques 352 451; Le temps de rétention de la bêta - lactoglobuline a est de 25467 min, le facteur d'asymétrie est de 1,00 et le nombre de plateaux théoriques est de 373 359. L'alpha - lactalbumine est séparée de la bêta - lactoglobuline B par 17,77 et la bêta - lactoglobuline B par 4,33.

3.2 spectrogramme de superposition de localisation de solution étalon unique d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline

Figure 2 spectrogramme de superposition de localisation de solution étalon unique d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (cliquez pour l'agrandir)

Un chromatogramme de localisation monométrique et un spectrogramme de l'alpha - lactoglobuline et de la bêta - lactoglobuline ont chacun une absorption caractéristique à 200 nm et 279 nm, comme le montre la figure 2.

3.3 spectrogramme de superposition d'échantillons en continu pour solution standard mixte d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline

Figure 3 spectrogramme de superposition d'échantillons en continu (100 µg / ML, n = 4) pour une solution mixte d'étalons alpha - lactalbumine et bêta - lactoglobuline (cliquez pour agrandir l'image)

La solution standard mixte d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (100 µg / ML) a été prélevée quatre fois de suite, avec un temps de rétention et une DSR de moins de 0,3% de la surface du pic, une bonne reproductibilité de la méthode, des profils de séparation et des données détaillées dans la figure 3.

3.4 courbes d'étalonnage des solutions étalons d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline superposition des spectres

Figure 4 spectrogramme de superposition des courbes d'étalonnage des solutions étalons d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (0,00 / 40,0 / 80,0 / 120 / 160 / 200 μg / ML) (cliquez pour agrandir l'image)

Les niveaux d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline sont généralement plus élevés dans le lait cru de vache et le lait pasteurisé, ce qui a permis de choisir la gamme linéaire recommandée par les normes T / tdstia 002 - 2021 et t / tdstia 007 - 2019. Comme le montre la figure 4, gamme linéaire de solutions standard d'alpha - lactalbumine 0,00 - 200 μg / ML, coefficient de corrélation linéaire r²≥ 09997, gamme linéaire de solutions standard de bêta - lactoglobuline 0,00 - 200 μg / ML, coefficient de corrélation linéaire r²≥ 09991, bonne linéarité. Dans laquelle la bêta - lactoglobuline B et la bêta - lactoglobuline a ont été quantifiées en utilisant le Groupe de composés.

3.5 solution standard d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (40,0 μg / ML) superposée à la solution vierge

Figure 5 spectrogramme de superposition de la solution standard d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (40,0 μg / ML) avec la solution vierge (cliquez pour l'agrandir)

Lorsque le volume de l'échantillon d'admission est de 10 µl, on choisit une valeur moyenne de bruit de matrice de n de 22,5 à 24,0 min avec une hauteur de crête de s pour l'alpha - lactalbumine et la bêta - lactoglobuline (40,0 µg / ML) et un rapport signal sur bruit S / N de 523,3, 139,9 et 133,6 pour l'alpha - lactalbumine, la bêta - lactoglobuline B et la bêta - lactoglobuline a, respectivement, comme représenté sur la figure 5. Par conséquent, avec l'optimisation du volume de l'échantillon, la sensibilité des méthodes de dosage de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline peut également répondre aux exigences de 1,00 μg / ML dans NY / t 4630 - 2025.

3.6 spectrogramme de superposition d'une solution d'étalon mixte d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline avec une solution d'échantillon de lait pasteurisé

Figure 6 spectrogramme de superposition d'une solution standard mixte d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline avec une solution d'échantillon de lait pasteurisé (cliquez pour l'agrandir)

En plus de la protéine de lactosérum, le lait de vache contient de grandes quantités de caséine et d'autres protéines qui peuvent interférer avec la détermination de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline. Après que l'échantillon de lait pasteurisé ait été soumis à des opérations de prétraitement telles que l'ajustement du pH, la centrifugation à haute vitesse, etc., l'alpha - lactalbumine et la bêta - lactoglobuline non dénaturées restent dans le surnageant, dont la séparation conserve un meilleur type de pic, une ligne de base stable et aucune perturbation Au pic, comme le montre la figure 6. Quantifiés par la méthode de l'étalon externe, les échantillons de lait pasteurisé contenaient 1 033,6 mg / kg d'alpha - lactoglobuline et 2 949,0 mg / kg de bêta - lactoglobuline, ce qui correspond essentiellement aux valeurs indiquées sur l'étiquette.

3.7 spectrogrammes et données de séparation des échantillons de lait pasteurisé (lait cryogénique), de lait ultra - pasteurisé (lait ordinaire) et de préparations pour nourrissons et jeunes enfants

Figure 7 spectrogramme de séparation de la solution d'échantillon de lait pasteurisé (lait cryogénique) et données

(cliquez pour l'agrandir)

Figure 8 spectrogramme et données de séparation de la solution d'échantillon de lait ultra - stérilisé (lait ordinaire)

(cliquez pour l'agrandir)

Figure 9 spectrogrammes et données de séparation de solutions d'échantillons de préparations pour nourrissons et jeunes enfants

(cliquez pour l'agrandir)

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L'alpha - lactalbumine et la bêta - lactoglobuline sont sensibles à la température, ce qui peut perturber leur structure chimique et leur activité biologique. Comme le montre la figure 7 - 9, il n'y a pas de pics d'interférence significatifs près des pics cibles de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline dans le lait pasteurisé (lait cryogénique), la quasi - certitude et la quantification, les échantillons de lait cru de vache, de lait pasteurisé, etc. sont applicables à la première méthode NY / t 4630 - 2025; Alors que le lait ultra - pasteurisé (lait ordinaire) et la formule pour nourrissons et jeunes enfants ont des pics d'interférence visibles près du pic cible de bêta - lactoglobuline, affecteront gravement les résultats qualitatifs et quantitatifs, l'alpha - lactalbumine est relativement peu affectée, le lait ultra - pasteurisé, la formule pour nourrissons et jeunes enfants et d'autres échantillons ne sont pas applicables à la première méthode NY / t 4630 - 2025, la deuxième méthode est recommandée.

3.8 chromatographie par perméation de gel de solution standard d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (deuxième méthode)

Figure 10 chromatogramme de perméation de gel de solutions standard d'alpha - lactalbumine et de bêta - lactoglobuline (500 mg / l) (cliquez pour agrandir l'image)

En référence à l'article "volumic exclusion Chromatography Determination of alpha - lactalbumine in Milk, lactosérum Powder, Whey powder" (2022) de sensei dujou, publié dans la revue China dairy industry, utilisant en tandem deux colonnes de chromatographie d'exclusion volumique mabpac sec - 1 (300 Å, 5 µm, 7,8 x 300 mm) En élution isocratique avec 6 m de chlorhydrate de Guanidine comme phase mobile, permettant une séparation efficace de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactalbumine à 280 nm (illustrée sur la figure 10) et testant 60 lots de lait, de lait en poudre et de lactosérum en poudre pour vérifier l'applicabilité et la stabilité de la méthode.Les cartes et données pertinentes sont détaillées dans le texte original.

Les spécifications de la colonne de chromatographie mabpac sec - 1 sont7,8 × 300mm， Le débit recommandé est de 0,5 ml / min, ce qui permet d'économiser du solvant en assurant le degré de séparation, facultatif4,0 × 300Colonne chromatographique de calibre mm, débit recommandé de 0,2 ml / MIN (réglable le cas échéant).

NY / t 4630 - 2025 consommables chromatographiques connexes recommandés

4.1 première méthode colonne d'analyse et colonne de protection par chromatographie liquide en phase inverse
Accucore 150 C4, 2,6 μm, 4,6 x 150 mm	(N/P : 16526-154630)
Noyau de colonne de protection accucore 150 C4, 2,6 μm, 4,0 × 10 mm, 4 PK	(N/P : 16526-014005)
Housse de colonne de protection uniguard à connexion directe	(P/N : 850-00)

4.2 deuxième méthode colonne d'analyse et colonne de protection par chromatographie par perméation de gel

Débit:0.5mL/min
保护柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 50 mm	(N/P : 074697)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7,8 x 300 mm	(N/P : 088460)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 7,8 x 300 mm	(N/P : 088460)

Débit:0.2mL/min
保护柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 50 mm	(N/P : 074697)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 300 mm	(N/P : 074696)
分析柱： MAbPac SEC-1, 5 μm, 300 Å, 4,0 x 300 mm	(N/P : 074696)

4.3 traitement avant échantillon
Titan 3 filtre à aiguille en PTFE hydrophile, 17 mm, 0,2 μm, 200 / PK	(N/P : 42213-NPL)

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Références

[1] NY / t 4630 - 2025 dosage de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline dans le lait de vache et ses produits par chromatographie liquide à haute performance

[2] t / tdstia 026 - 2022 dosage de l'alpha - lactalbumine, de la bêta - lactoglobuline dans les préparations pour nourrissons et jeunes enfants - chromatographie par perméation de gel

[3] t / tdstia 002 - 2021 détermination de l'alpha - lactalbumine dans le lait et les produits laitiers chromatographie liquide à haute performance

[4] t / csiq 77001 - 2020 détermination de la teneur en alpha - lactalbumine des produits laitiers par chromatographie liquide à haute performance

[5] t / tdstia 007 - 2019 dosage de la bêta - lactoglobuline dans le lait et les produits laitiers par chromatographie liquide

[6] t / shnx 001 - 2025 dosage de la Lactoferrine, de l'alpha - lactalbumine et de la bêta - lactoglobuline dans le lait cru de vache - spectrométrie de masse en tandem

[7] duzhu Lu, Wang Liang, Lin Yi. Détermination de la teneur en alpha - lactalbumine dans le lait, la poudre de lait, la poudre de lactosérum par chromatographie d'exclusion volumique [j]. China dairy industry, 2022,50 (04): 46 - 51.

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