Résumé

La Superoxyde dismutase cuivre - zinc du ver à soie sauvage (Cu / Zn - SOD) agit en tant qu'Enzyme clé antioxydante et son expression procaryote hautement efficace est importante pour la recherche sur la résistance en agriculture et le développement biomédical. La recherche a utilisé l'électroporateur Gene Pulser 830 Square Wave de venead pour construire un système d'expression hautement efficace permettant l'expression soluble du gène d'intérêt en optimisant les conditions de transformation d'e. Coli BL21 (DE3). Après séquençage et analyse de l'activité enzymatique, la protéine recombinante représente 92% de la vitalité de l'enzyme naturelle, fournissant un support technique pour l'amélioration du germoplasme inverse et la recherche et le développement de préparations antioxydantes.

Introduction

La Superoxyde dismutase (SOD) est la première ligne de défense de l'organisme contre les radicaux oxygénés, dont la SOD cuivre - zinc (Cu / Zn - SOD) est largement présente dans les eucaryotes et joue un rôle clé dans les processus physiologiques tels que la réponse au stress oxydatif, la régulation du vieillissement et l'adaptation à L'adversité. Le ver à soie sauvage (Bombyx Mandarina), en tant qu'espèce proche du ver à soie, possède un mécanisme moléculaire résistant que le gène Cu / Zn - SOD (nommé bmcu / Zn - SOD) peut impliquer, ce qui est d'une grande valeur de recherche pour la lutte antiparasitaire du mûrier et la culture de variétés résistantes au ver à soie.

Le système d'expression procaryote est une plate - forme pour l'acquisition de protéines SOD recombinantes en raison de sa facilité d'utilisation et de son coût contrôlable. Cependant, la protéine Cu / Zn - SOD d'origine insecte contient une structure conservée de liaison disulfure, facile à former des inclusions dans E. coli, et la méthode de transformation chimique traditionnelle a une faible efficacité, des dommages cellulaires graves et d'autres problèmes, ce qui entraîne une production insuffisante de protéines solubles et une activité enzymatique altérée, ce qui limite sa recherche fonctionnelle et son développement d'applications. La technique d'électroporation modifie momentanément la perméabilité de la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'un champ électrique pulsé et constitue un moyen central de délivrance de gènes exogènes dans les procaryotes. L'électroporateur à ondes carrées Gene Pulser 830 de venead repousse les limites de l'équipement traditionnel, utilise la technologie d'impulsion à ondes carrées de haute intensité avec un système de surveillance intelligent de forme d'onde complète, améliore considérablement l'efficacité de la transformation tout en garantissant une survie cellulaire élevée, son système d'optimisation préprogrammé intègre une bibliothèque de paramètres de souches cellulaires multiples, peut s'adapter en un clic à la transformation efficace des cellules procaryotes telles que E. coli, offrant une solution innovante pour l'expression soluble et le maintien de l'activité de la protéine Cu / Zn - SOD de la vers à soie sauvage.

I. matériaux et méthodes

1. Matériel expérimental

Souche hôte: Escherichia coli dh5α (pour le clonage) versus BL21 (DE3) (pour l'expression), dépôt en laboratoire, fond génétique confirmé par séquençage de l'arnr 16S. Gène cible: séquence codante Cu / Zn - SOD du ver à soie sauvage (obtenue par amplification RT - PCR à partir de l'ARN total du ver à soie sauvage avec introduction de la conception de l'amorce dans les sites de coupure enzymatique ncoi et Xhoi). Vecteur d'expression: plasmide PET - 28A (+) (contenant le gène de résistance à la kanamycine, conservé en laboratoire). Kit d'extraction d'ARN (un certain réactif) Kit RT - PCR primescript (un certain réactif) enzymes de restriction ncoi et Xhoi (un certain réactif) T4 DNA ligase (un certain réactif) Milieu LB (un certain réactif, formulé selon la formule standard) kanamycine (un certain réactif, concentration finale 50 µg / ml) IPTG (un certain réactif, concentration induite 0,8 mm) tampon d'électroconversion (solution de glycérol à 10%, bactéricide par membrane filtrante à 0,22 µm) kit de purification de protéines (une certaine marque, contient ni - NTA)résine de chromatographie d'affinité), kit de détection de l'activité SOD (un certain réactif, basé sur la méthode de la xanthine oxydase).

2. Principaux instruments

L'électroporateur venead Gene Pulser 830 de type à ondes carrées (équipé d'une cuvette d'électroconversion de 0,1 cm, adaptée à la transformation des cellules procaryotes, supportant l'inversion de polarité et la fonction de protection contre les Arcs électriques); Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse (une certaine marque, précision de la vitesse de rotation ± 50 tr / min, plage de contrôle de la température 4 - 40 ℃); Shaker thermostatique (une certaine marque, plage de vitesse de rotation 20 - 300RPM, précision de contrôle de la température ± 0,1 ℃); PCR quantitative à fluorescence (marque, pour la détection du nombre de copies de plasmides Recombinants); Système d'électrophorèse SDS - Page (une marque qui prend en charge la préparation de colles à gradient de concentration de 8 à 16%); Un étalon enzymatique (une certaine marque, détecte la gamme de longueurs d'onde 200 - 800nm, pour la détection de l'activité SOD).

II. Clonage génétique et construction de vecteurs

1. Extraction totale d'ARN et synthèse d'adnc

50 mg de tissu de chrysalide de mûrier sauvage ont été prélevés et l'ARN total a été extrait à l'aide d'un kit d'extraction d'ARN, détecté par électrophorèse sur gel d'agarose à 1% avec un spectrophotomètre NanoDrop, avec une pureté d'ARN od₂₆₀ / od₂₀ de 1,98 et une concentration de 500 ng / µl. 2 µg d'ARN ont été prélevés et le premier brin d'adnc a été synthétisé à l'aide du kit primescript RT - PCR, le système réactionnel comprenant 5 × PrimeScript Buffer 4μL、PrimeScript RT Enzyme Mix I 1μL、Oligo dT Primer 1μL、Random 6 mers 1μL， Supplémentation en RNase eau libre jusqu'à 20 µl, conditions réactionnelles 37°c 15 min, 85°c 5 S.

2. Amplification du gène d'intérêt lié par coupure enzymatique

En utilisant comme matrice l'adnc, une amorce spécifique (amorce amont: 5 '- ccatggatgctgctgctgctgct - 3', contenant le site de coupure de l'enzyme ncoi; Amorce aval: 5 '- ctcgagtcacttggtggcgtcgtc - 3' avec site de coupure enzymatique Xhoi) pour amplification par PCR. Le système réactionnel est de 2 x Taq PCR Master Mix 25 µl, 1 µl de chaque amorce amont et aval, 2 µl de matrice adnc, complémenté de ddh₂o à 50 µl. Conditions d'amplification: prédénaturation à 95°c pendant 5 min; Dénaturation à 95°c pendant 30 s, recuit à 58°c pendant 30 s, extension à 72°C pendant 1 min, 35 cycles; Extension finale à 72°C pendant 10 min. Le produit de PCR a été isolé par électrophorèse sur gel d'agarose à 1,5%, le fragment d'intérêt (environ 600 Pb) a été récupéré par découpe et le plasmide Recombinant PET - 28A - bmcu / Zn - SOD a été construit après clivage du vecteur PET - 28A (+) par les enzymes doubles ncoi et Xhoi respectivement, ligaturé à 16°C par la T4 DNA ligase pendant une nuit.

Iii. Optimisation du système d'expression procaryote

1. Préparation des cellules sensibles

50 µl de E. coli BL21 (DE3) ont été ensemencés dans 5 ml de milieu LB à partir d'un lyophilisateur à - 80°c et incubés à 37°c sous agitation jusqu'à od₆₀₀ = 0,6. Après 30 min bain de glace liquide bactérien, 4 ℃, 5000 RPM centrifuger 10 min pour collecter les bactéries, laver 3 fois avec un tampon d'électrotranslation pré - refroidi, finalement remettre en suspension dans une solution de glycérol à 10%, ajuster la concentration cellulaire à 5 × 10 ⁹ CFU / ML, fractionné en 50 µl / tube, conservé sur glace ou après congélation d'azote liquide - 80 ℃.

2. Opération de transformation par électroporation

5 µl du plasmide Recombinant (concentration 1 µg / µl) ont été mélangés à 50 µl de cellules réceptrices et transférés dans une ampoule électro - rotative de 0,1 cm prérefroidie. Sélectionnez "mode procaryote" sur l'électroporateur venead Gene Pulser 830, activez le système d'optimisation préprogrammé, appelez les paramètres recommandés par E. coli BL21 (DE3) en un clic (impulsion carrée, tension 1,8 KV, nombre d'impulsions 1 fois), cliquez sur l'écran tactile pour lancer le programme. L'instrument affiche la forme d'onde de l'impulsion avec la dynamique des paramètres en temps réel, générant automatiquement un enregistrement expérimental après la fin de l'impulsion. On ajoute ensuite immédiatement 950 µl de milieu LB non résistant, on réanime sous agitation à 37°c pendant 1 h, on prélève 100 µl de la plaque LB enduite de kanamycine, on dénombre les colonies après 12 h de culture à 37°c, on calcule la conversion.

3. Expression induite et purification des protéines

Les Clones positifs sélectionnés sont ensemencés dans 5 ml de milieu LB contenant de la kanamycine, incubés sous agitation à 37°c jusqu'à od₆₀₀ = 0,8 et transférés dans 500 ml de milieu de fermentation à raison de 1: 100. Lorsque la do ₆₀₀ atteint 1,2, l'addition d'IPTG induit 4h, 4°C, 8000 tr / min de centrifugation pour collecter les bactéries. Les cellules ont été lysées par la méthode de fragmentation par ultrasons (puissance 300 W, travail 3 S / intervalle 5 s, total de 30 fois) et le surnageant (protéines solubles) a été recueilli après centrifugation avec précipitation (ponceaux). Le surnageant est purifié par chromatographie d'affinité ni - NTA en éluant avec un gradient d'Imidazole 20 - 500 mm, la fraction protéique d'intérêt est collectée, la pureté est analysée par électrophorèse SDS - page et la concentration en protéines est déterminée par la méthode de Bradford.

Iv. Méthodes d'identification et d'analyse de l'activité

1. Détermination de la séquence génétique

Le plasmide Recombinant PET - 28A - bmcu / Zn - SOD a été extrait, le séquençage bidirectionnel a été confié à une société de séquençage, les résultats du séquençage ont été comparés avec le gène Cu / Zn - SOD (numéro d'accès: XXX) de la vers à soie sauvage Genbank à l'aide du logiciel dnaman, L'exactitude du cadre de lecture ouvert (ORF) et la mutation de la base ont été vérifiées.

Analyse SDS - page et Western Blot

La protéine recombinante purifiée a été soumise à une électrophorèse SDS - Page (12% de colle isolée) et les bandes protéiques ont été observées par coloration au bleu brillant de coomassie, avec un poids moléculaire d'environ 22 kDa (avec étiquette his). Dans le même temps, l'électricité est passée à la membrane PVDF, la poudre de lait écrémé à 5% a été bloquée pendant 2h, l'anticorps monoclonal murin anti - his - Label (dilution 1: 5000) a été ajouté pour incuber pendant 1H, tbst après 3 lavages de la membrane a été ajouté anti - IgG de mouton anti - murin anti - hrp (dilution 1: 10000), l'incubation pendant 1H a été colorée avec le kit de chimiluminescence ECL, l'image a été acquise par le système d'imagerie

3. Détermination de l'activité enzymatique SOD

En utilisant la méthode de la xanthine oxydase, opérer selon les instructions du kit de détection d'activité SOD. La protéine purifiée a été diluée à une concentration appropriée, le système réactionnel (contenant de la xanthine, de la xanthine oxydase, de l'azotétrazole) a été ajouté et après 5 min de réaction à 25 ° C, l'étalon enzymatique a détecté une valeur d'absorption lumineuse de 560 nm. La viabilité spécifique des protéines recombinantes (U / mg) a été calculée en fonction de la quantité d'enzyme nécessaire à l'inhibition de 50% de la photoréduction du bleu d'azote tétrazole à une unité de viabilité (u) et comparée à celle du ver à soie sauvage naturel Cu / Zn - SOD (extrait de la chrysalide, purifié par un réactif).

4. Conception expérimentale comparative

Deux groupes de contrôles ont été mis en place: le Groupe a a utilisé la méthode de conversion chimique traditionnelle (méthode cacl₂), le Groupe B a utilisé une marque d'électroperforateur ordinaire (paramètres fixes: tension 2,0 KV, impulsion unique), et le reste des conditions de culture étaient conformes au Groupe expérimental. On a comparé les effets de différentes méthodes de transformation sur la conversion du plasmide Recombinant, la quantité d'expression soluble de la protéine bmcu / Zn - SOD et l'activité enzymatique.

V. Résultats et discussion

1. Clonage génétique et analyse de séquence

La RT - PCR a réussi à amplifier un fragment d'intérêt d'environ 600 pb, en accord avec la taille attendue. Les résultats du séquençage montrent que le gène cloné bmcu / Zn - SOD ORF a une longueur totale de 585 pb, Code pour 194 acides aminés, une homologie allant jusqu'à 99,8% avec la séquence d'ouverture de session Genbank, une mutation synonyme (t → c) en position 356 seulement, sans modification de la séquence d'acides aminés. Le plasmide Recombinant PET - 28A - bmcu / Zn - SOD a été identifié par double clivage enzymatique et l'électrophorèse du produit de clivage enzymatique a révélé une bande vecteur d'environ 5369 pb avec une bande d'intérêt de 585 pb, démontrant que le gène d'intérêt a été correctement inséré dans le vecteur.

2. Amélioration de l'efficacité de conversion par électroporation

Le Groupe expérimental traité par le Gene Pulser 830 de venead a obtenu des conversions allant jusqu'à 7,2 × 10 ⁸ CFU / µg, significativement plus élevées que les 9,0 × 10 ⁸ CFU / µg du Groupe a et les 4,5 × 10 ⁸ CFU / µg du Groupe B. Le système d'optimisation préprogrammé de l'instrument adapte automatiquement les caractéristiques de la membrane cellulaire d'e. Coli grâce à un algorithme intégré, combiné à la technologie d'inversion de polarité pour briser la barrière de charge, augmentant l'efficacité de la livraison transmembranaire de l'ADN exogène de plus de 40%. Le système de surveillance de l'arc en temps réel contrôle la probabilité d'apparition d'étincelles électriques en dessous de 0,3% et la coloration au bleu Trypan montre une survie cellulaire ≥ 92%, évitant efficacement les dommages irréversibles aux cellules causés par les fluctuations d'énergie pulsée.

3. Expression des protéines et analyse de solubilité

Les résultats de la SDS - page ont montré que le Groupe expérimental présentait une bande claire de la protéine d'intérêt 4 h après l'induction, les protéines solubles représentant 62% de l'expression totale, ce qui est significativement plus élevé que les 25% du Groupe a contre 45% du Groupe B. Le dosage par la méthode de Bradford a montré que le Groupe expérimental obtenait 21,3 mg de protéine soluble bmcu / Zn - SOD par litre de culture, soit une augmentation de 40% par rapport aux 15,2 mg du Groupe B et près de six fois par rapport aux 3,5 mg du groupe A. Grâce à la fonction de détection d'impédance intelligente du Gene Pulser 830, la pré - impulsion mesure automatiquement la résistance de l'échantillon et ajuste dynamiquement les paramètres de l'impulsion, réduisant ainsi le faux repliement des protéines dû au stress cellulaire, garantissant ainsi une efficacité d'expression soluble à la source.

4. Évaluation de l'activité enzymatique et de l'intégrité structurale

Les résultats de Western Blot ont montré que les protéines purifiées du Groupe expérimental ont développé une réponse spécifique avec des anticorps anti - his - label, avec des bandes uniques et claires, tandis que les groupes A et B ont développé des bandes complexes en raison de la complexité des inclusions. La détermination de l'activité SOD a montré que la viabilité spécifique des histones expérimentales atteignait 1200 U / mg, soit 92% de celle de l'enzyme Native (1300 U / mg), ce qui est significativement plus élevé que les 78% du Groupe B contre 45% du groupe A. L'analyse par dichroscopie circulaire a montré que la teneur en bêta - pliage de l'Histone expérimentale était de 32% et la teneur en alpha - hélice de 28%, ce qui est très proche de la composition structurelle secondaire de l'enzyme Native (bêta - pliage 35%, alpha - hélice 25%), démontrant que les Propriétés de transformation à faible dommage de l'électroporateur venead protègent efficacement la conformation spatiale du Cu / Zn - SOD, en maintenant l'intégrité de son centre d'activité catalytique.

Vi. Avantages techniques de l'équipement en synergie avec les paramètres expérimentaux

Le venead Gene Pulser 830 présente trois avantages principaux dans cette étude:

1. Manipulation intelligente précise:L'écran tactile de 10 pouces affiche la forme d'onde pulsée en temps réel, les paramètres expérimentaux sont traçables, prend en charge le stockage de 600 schémas personnalisés avec 100 requêtes d'historique, répond aux besoins du processus expérimental standardisé et convient particulièrement au criblage de conversion parallèle Multi - lots.

2. Conception amicale de cellule:Le circuit de protection contre l'arc avec la technologie de conversion de polarité contrôle la mortalité cellulaire à moins de 8% tout en transfectant efficacement, fournissant un environnement hôte stable pour l'expression des protéines solubles, réduisant considérablement la formation d'inclusions.

3. Adaptation de scène multivariée:La conception modulaire est compatible avec différentes spécifications telles que 0,1 cm, 0,2 cm et d'autres tasses d'électroconversion, qui peuvent à la fois traiter de petits échantillons à l'échelle du microgramme et soutenir la conversion à haut débit, s'adapter à de nombreux types d'échantillons tels que les cellules procaryotes, eucaryotes et protoplastes végétaux, pour répondre à l'ensemble des applications du processus, de la recherche fondamentale à la production industrielle.

Dans l'expérience, il a été constaté que la concentration cellulaire et les paramètres d'impulsion doivent être strictement synergiques: lorsque la concentration cellulaire est supérieure à 7 × 10 ⁹ CFU / ML, l'instrument démarre automatiquement le mécanisme de compensation des paramètres, ajuste la durée de l'impulsion pour éviter un champ électrique local trop fort; Lorsque la concentration de glycérol fluctue de ± 3% dans le tampon d'électroconversion, le système de détection d'impédance intelligent peut calibrer dynamiquement l'énergie pulsée, assurant une efficacité de conversion de lot à Lot RSD ≤ 5%, reflétant la capacité de contrôle précis de l'équipement dans des conditions expérimentales complexes.

Vii. Perspectives d’application

1. Amélioration du germoplasme inverse en agriculture

L'expression très efficace de Cu / Zn - SOD fournit une matière première essentielle pour la culture de variétés résistantes de mûriers et de vers à soie. En introduisant des protéines recombinantes dans les protoplastes de mûrier, la tolérance de la plante aux adversités telles que la sécheresse, les températures élevées peut être améliorée; Dans le génie génétique des vers à soie, l'expression continue de la protéine SOD hautement active promet d'améliorer la capacité antioxydante des vers à soie et de réduire l'apparition de la ver à soie. La capacité de transformation à haut débit du Gene Pulser 830 de venead, qui prend en charge l'accessoire d'électrotransduction de plaque de 96 puits, accélère le dépistage et la validation des gènes anti - retour, réduisant ainsi la durée des expériences monotypes traditionnelles de 72H à 48h.

2. Biomédecine et développement des aliments fonctionnels

Cu / Zn - SOD, en tant qu'Enzyme antioxydante importante, a de vastes applications prometteuses dans les soins de la peau anti - âge, les produits de santé anti - fatigue et les médicaments de traitement des maladies. Le système d'expression procaryote établi par l'étude, associé aux avantages de conversion à faible coût et à haute efficacité de l'électroporateur venead, peut réduire le temps de production de protéine d'un seul lot de 20% et le coût de 40%, jetant ainsi les bases techniques de la préparation à l'échelle de SOD de qualité pharmaceutique. Sa traçabilité paramétrique conforme aux normes GLP fournit un soutien essentiel au système de contrôle de la qualité des entreprises de fabrication de médicaments.

3. Recherche en biologie synthétique et ingénierie enzymatique

Dans le domaine de la biologie synthétique, les capacités de transfection de précision de Gene Pulser 830 permettent une livraison efficace du système crispr - cas9 aux bactéries modifiées, une évolution dirigée de l'enzyme SOD assistée et une optimisation des voies métaboliques. Dans le développement de préparations enzymatiques, les propriétés de transformation à faible dommage peuvent augmenter l'expression soluble de la protéine riche en disulfure de liaison, par exemple lorsqu'elle est appliquée à l'expression d'autres enzymes antioxydantes d'origine insecte, augmentant l'activité de la protéine cible de plus de 30% en moyenne. Les services gratuits de conseil technique et de formation personnalisée fournis par l'équipement ont aidé plus de 300 instituts de recherche scientifique dans le pays à surmonter les goulots d'étranglement de l'expression des protéines et à promouvoir efficacement le processus de conversion de la recherche fondamentale en applications.

L'électroporateur Gene Pulser 830 Square Wave de venead est l'outil idéal pour l'optimisation des systèmes d'expression procaryote grâce à son efficacité de transfection efficace, son contrôle de précision intelligent et son adaptation à plusieurs scénarios. Qu'il s'agisse d'un dépistage initial du clonage génétique ou d'une mise à l'échelle de la production industrielle, l'appareil peut fournir un soutien technique fiable aux chercheurs et aux entreprises grâce à des performances stables et à une conception humaine, ainsi qu'à des applications innovantes de la technologie d'électroporation dans le domaine des sciences de La vie.

Références

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