Résumé

La protéine VP2 du virus de la fièvre aphteuse agit comme un antigène Structural important et l'analyse antigénique de ses produits d'expression procaryote est essentielle à la recherche et au développement de nouveaux vaccins. Étude de la construction d'un système d'expression efficace à l'aide de l'électroporateur économique Mini Pulser 399 de venead, permettant l'expression soluble de la protéine VP2 en optimisant les conditions de transformation d'e. Coli BL21 (DE3). Validés par ELISA avec Western Blot, les produits d'expression se lient spécifiquement aux anticorps du virus de la fièvre aphteuse jusqu'à 89% de l'activité de la protéine native, fournissant un support technique pour la production de matières premières vaccinales à faible coût.

Introduction

La fièvre aphteuse (FMD) est une maladie infectieuse puissante qui nuit à l'élevage et dont la protéine de structure VP2, l'agent pathogène du virus de la fièvre aphteuse (fmdv), est impliquée dans l'assemblage de la capside virale et est un vecteur épitopique antigénique clé qui induit la production d'anticorps neutralisants par l'hôte. Le système d'expression procaryote est une plate - forme pour la production à grande échelle de protéines antigéniques VP2 en raison de sa facilité d'utilisation et de son faible coût. Cependant, la protéine VP2 est riche en structures bêta - pliantes, sujettes à la formation d'inclusions chez E. coli, et les méthodes de transformation traditionnelles présentent des problèmes tels que l'inefficacité et les dommages cellulaires graves, ce qui entraîne une production insuffisante de protéines solubles et une conformation antigénique fragile, ce qui limite son utilisation dans le développement de vaccins.

La technique d'électroporation modifie momentanément la perméabilité de la membrane cellulaire par l'intermédiaire d'un champ électrique pulsé et constitue un moyen central de délivrance de gènes exogènes dans les procaryotes. L'électroporateur économique Mini Pulser 399 de venead repousse les limites de l'équipement traditionnel et utilise la technologie d'impulsion d'onde exponentielle de haute précision avec un système de surveillance d'arc en temps réel pour améliorer considérablement l'efficacité de la conversion tout en garantissant un taux de survie élevé des cellules. Son interface de fonctionnement minimaliste ne nécessite que le réglage des paramètres de tension pour déclencher en un clic et, en conjonction avec la conception indépendante de l'électrotranspose, peut être adaptée de manière flexible à de nombreux types d'échantillons tels que les cellules procaryotes, les cellules eucaryotes et les micro - organismes, offrant une solution innovante pour l'expression efficace et le maintien de l'antigénicité de la protéine VP2 de la fièvre aphteuse.

I. matériaux et méthodes

1. Matériel expérimental

Souche hôte: Escherichia coli BL21 (DE3) (dépôt en laboratoire, confirmation du contexte génétique par séquençage de l'arnr 16S) gène cible: souche O du virus de la fièvre aphteuse séquence codante VP2 (amplifiée à partir de l'ARN viral par RT - PCR, vérifiée par la séquence d'une société de réactifs) vecteur d'Expression: plasmide PET - 32A (+) (contenant le gène de résistance à l'ampicilline, conservé en laboratoire) réactifs: milieu LB (un réactif, formulé selon la formule standard) ampicilline (un réactif, concentration finale de 100 µg / ML) IPTG (un réactif, concentration induite)0,5 mm), tampon d'électrotransduction (solution de glycérol à 10%, bactéricide par membrane filtrante à 0,22 µm), kit de purification des protéines (une certaine marque avec une résine de chromatographie d'affinité ni - NTA), anticorps polyclonaux spécifiques du virus de la fièvre aphteuse (fabriqués maison en laboratoire, efficacité ≥ 1: 10 000 vérifiée par ELISA)

2. Principaux instruments

Mini Pulser 399 Economy electroporator (équipé d'une cuvette d'électro - rotation de 0,1 cm, adaptée à la transformation des cellules procaryotes, prise en charge indépendante du système expérimental de changement rapide) centrifugeuse réfrigérée à grande vitesse (d'une certaine marque, précision de la vitesse de rotation ± 50 tr / min, plage de contrôle de La température de 4 à 40 ° c) agitateur thermostatique (d'une certaine marque, plage de vitesse de rotation 20 - 300 tr / min, précision de contrôle de la température ± 0,1 ° c) PCR quantitative fluorescente (d'une certaine marque, pour la détection du nombre de copies de plasmides Recombinants) Système d'électrophorèse SDS - page gamme de longueur d'onde de détection 200 - 800nm pour l'analyse ELISA)

II. Construction du système d'expression procaryote

1. Construction de plasmide recombinant

Après clivage enzymatique double ndei et Xhoi de la séquence codante VP2, ligaturée avec le vecteur PET - 32A (+) également traité par clivage enzymatique, elle est transformée en cellules réceptrices dh5alpha d'e. Coli. Les monocolonies ont été sélectionnées dans du milieu LB contenant de l'ampicilline et cultivées sous agitation à 37°c pendant 12h, les plasmides ont été extraits et soumis à une électrophorèse sur gel d'agarose avec vérification du séquençage pour obtenir le plasmide Recombinant correct PET - 32A - VP2.

2. Préparation des cellules sensibles

50 µl de E. coli BL21 (DE3) ont été ensemencés dans 5 ml de milieu LB à partir d'un lyophilisateur à - 80°c et incubés à 37°c sous agitation jusqu'à od₆₀₀ = 0,6. Après 30 min bain de glace liquide bactérien, 4 ℃, 5000 RPM centrifuger 10 min pour collecter les bactéries, laver 3 fois avec un tampon d'électrotranslation pré - refroidi, finalement remettre en suspension dans une solution de glycérol à 10%, ajuster la concentration cellulaire à 5 × 10 ⁹ CFU / ML, fractionné en 50 µl / tube, conservé sur glace ou après congélation d'azote liquide - 80 ℃.

3. Optimisation de la conversion par électroporation

5 µl du plasmide Recombinant (concentration 1 µg / µl) ont été mélangés à 50 µl de cellules réceptrices et transférés dans une ampoule électro - convertisseur pré - refroidie de 0,1 cm. Sélectionnez le « mode cellule procaryote » sur l'électroporateur Mini Pulser 399 de venead, réglez le paramètre de tension à 1,8 kV (optimisé selon la pré - expérience), cliquez sur le bouton « démarrage en un clic » de l'écran tactile et l'instrument génère automatiquement des impulsions d'ondes exponentielles de haute précision. Immédiatement après la fin de l'impulsion, on ajoute 950 µl de milieu LB non résistant, on réanime par Oscillation à 37°c pendant 1H, on prélève 100 µl d'une plaque LB enduite d'ampicilline, on dénombre les colonies après 12h de culture à 37°c, on calcule la conversion.

4. Expression induite et purification des protéines

Les Clones positifs sélectionnés sont ensemencés dans 5 ml de milieu LB contenant de l'ampicilline, incubés à 37°c sous agitation jusqu'à od₆₀₀ = 0,8 et transférés dans 500 ml de milieu de fermentation à raison de 1: 100. Lorsque la do ₆₀₀ atteint 1,2, l'addition d'IPTG induit 4h, 4°C, 8000 tr / min de centrifugation pour collecter les bactéries. Les cellules ont été lysées par la méthode de fragmentation par ultrasons (puissance 300 W, travail 3 S / intervalle 5 s, total de 30 fois) et le surnageant (protéines solubles) a été recueilli après centrifugation avec précipitation (ponceaux). Le surnageant est purifié par chromatographie d'affinité ni - NTA en éluant avec un gradient d'Imidazole 20 - 500 mm, la fraction protéique d'intérêt est collectée, la pureté est analysée par électrophorèse SDS - page et la concentration en protéines est déterminée par la méthode de Bradford.

Iii. Méthodes d'analyse de l'antigénicité

Détection Western Blot

La protéine VP2 purifiée est électrolysée sur membrane PVDF après séparation par SDS - page, la poudre de lait écrémé à 5% est bloquée pendant 2h, les anticorps polyclonaux spécifiques du virus de la fièvre aphteuse (dilution 1: 5000) sont ajoutés pendant 1H, les IgG de mouton anti - lapin anti - hrp (dilution 1: 10000) sont ajoutés après 3 lavages de membrane tbst, les images sont acquises par le système d'imagerie par gel après 1H d'incubation.

2. Analyse Quantitative ELISA

La protéine purifiée a été bloquée par une plaque de 96 puits en paquets de 1 µg / ML pendant 2h avec du BSA à 1% après une nuit à 4°C. Du sérum positif au virus de la fièvre aphteuse dilué dans un gradient (dilution initiale 1: 100) a été ajouté, incubé pendant 1h à 37°c, des anticorps anti - IgG porcine de mouton marqués HRP (dilution 1: 5000) ont été ajoutés après lavage de la plaque, incubés pendant 30min à 37°c, la réaction a été terminée avec du h₂so₄ 2m après coloration TMB, et l'amplitude enzymatique a détecté une valeur d'absorption lumineuse de 450 nm. L'activité antigénique relative a été calculée avec la protéine VP2 Native comme témoin positif (valeur de do du Groupe expérimental / valeur de do du groupe témoin positif × 100%).

3. Conception expérimentale comparative

Deux groupes de contrôles ont été mis en place: le Groupe a a utilisé la méthode de conversion chimique traditionnelle (méthode cacl₂), le Groupe B a utilisé un électroporateur commun d'une marque (paramètres fixes: tension 2,0 kV / CM, impulsion unique), et le reste des conditions de culture ont été conformes au Groupe expérimental. Comparer les effets de différentes méthodes de transformation sur la conversion du plasmide Recombinant, la quantité d'expression soluble de la protéine VP2 et l'antigénicité.

Iv. Résultats et discussion

1. Analyse de l'efficacité de conversion par électroporation

Le Groupe expérimental traité par le mini Pulser 399 de venead a obtenu des conversions allant jusqu'à 6,5 × 10 ⁸ CFU / µg, significativement plus élevées que celles de 8,0 × 10 ⁸ CFU / µg pour le Groupe a et de 3,2 × 10 ⁸ CFU / µg pour le Groupe B. Les tests PCR quantitatifs par fluorescence ont montré une augmentation de 25% du nombre de copies plasmidiques de monobactéries dans le Groupe expérimental par rapport au Groupe B, ce qui suggère que sa technologie d'impulsion d'onde exponentielle de haute précision améliore efficacement l'efficacité de la livraison transmembranaire de l'ADN exogène. Le système de surveillance de l'arc en temps réel de l'instrument peut contrôler la probabilité d'apparition de l'étincelle électrique à moins de 0,5%, évitant les dommages irréversibles aux membranes cellulaires causés par les fluctuations d'énergie pulsée, ce qui maintient un taux de survie élevé des cellules réceptrices (la coloration au bleu Trypan montre un taux de survie cellulaire ≥ 90%).

2. Analyse de l'expression et de la solubilité des protéines

Les résultats de l'électrophorèse SDS - page montrent que le Groupe expérimental présente une bande claire de la protéine d'intérêt 4h après l'induction, avec un poids moléculaire d'environ 42 kDa, en accord avec les valeurs théoriques. L'analyse du logiciel imagej a montré que les protéines solubles du Groupe expérimental représentaient 58% de l'expression totale, ce qui est significativement plus élevé que les 22% du Groupe a contre 41% du Groupe B. La méthode de Bradford a montré que le Groupe expérimental a obtenu 18,7 mg de protéine VP2 soluble par litre de culture, soit une augmentation de 52% par rapport aux 12,3 mg du Groupe B et près de 9 fois par rapport aux 2,1 mg du groupe A. Ceci est rendu possible grâce à la conception conviviale des cellules du mini Pulser 399, dont les paramètres d'impulsion correspondent automatiquement aux caractéristiques de la membrane des cellules procaryotes grâce à un algorithme intégré qui réduit le mauvais repliement des protéines en raison du stress cellulaire, améliorant ainsi l'efficacité de l'expression soluble à la source.

3. Évaluation de l'activité antigénique

Les résultats de Western Blot ont montré que les protéines purifiées du Groupe expérimental ont développé une réponse spécifique avec les anticorps du virus de la fièvre aphteuse, la force de la bande étant compatible avec la protéine native, tandis que les groupes A et B ont présenté des bandes réactives plus faibles en raison de la réplication des inclusions. L'analyse quantitative Elisa a montré une activité antigénique relative des histones expérimentales allant jusqu'à 89%, ce qui est significativement plus élevé que les 65% du Groupe B contre 32% du groupe A. L'analyse par dichroscopie circulaire a montré une teneur en bêta - Repliement de 35% des histones expérimentales, proche de 38% de la protéine native, démontrant une intégrité structurelle secondaire supérieure à celle du témoin, validant davantage l'effet protecteur de l'électroporateur de weinight sur la conformation protéique dans la transformation à faible dommage.

V. avantage technique de l'équipement en synergie avec les paramètres expérimentaux

Le mini Pulser 399 de venead présente trois avantages principaux dans cette étude:

Efficacité de fonctionnement minimaliste: pas besoin de déboguer des paramètres complexes, seule la tension peut être réglée pour démarrer, les opérations novices prennent 40% moins de temps que les électroporateurs traditionnels, améliorant considérablement l'efficacité de l'expérience, en particulier pour le criblage de conversion Multi - lots.

Protection des impulsions de précision: les impulsions d'ondes exponentielles de haute précision, associées à la surveillance de l'arc en temps réel, contrôlent la mortalité cellulaire à moins de 10% tout en garantissant une transformation efficace, offrant un environnement hôte stable pour l'expression des protéines solubles.

Adaptation de scène multivariée: la conception indépendante de la tourelle électrique prend en charge la commutation rapide de 0,1 cm, 0,2 cm et d'autres spécifications différentes de la tourelle électrique, à la fois capable de traiter de petits échantillons à l'échelle du microgramme et compatible avec les besoins de conversion à haut débit, pour répondre à l'ensemble des applications de processus du laboratoire, de la recherche fondamentale à l'optimisation des processus.

Il a été constaté expérimentalement que la concentration cellulaire et les paramètres de tension doivent être étroitement coordonnés: lorsque la concentration cellulaire est supérieure à 8 × 10 ⁹ CFU / ML, la tension doit être ajustée à 1,6 kV pour éviter un champ électrique local trop intense; Lorsque la concentration de glycérol fluctue de ± 2% dans le tampon d'électroconversion, la fonction de compensation intelligente de l'instrument peut calibrer automatiquement l'énergie pulsée, assurant une efficacité de conversion stable (RSD ≤ 3% entre lots). Ces détails reflètent la capacité de contrôle précise de l'appareil dans des conditions expérimentales complexes, offrant une garantie fiable de répétabilité technique.

Vi. Perspectives d’application

1. Production industrielle de vaccins pour animaux

Le système d'expression du noyau protéinogène VP2 établi par l'étude peut être directement appliqué à la production à l'échelle de vaccins sous - unitaires contre la fièvre aphteuse. Grâce à son positionnement économique et à ses performances efficaces, le mini Pulser 399 de venead peut réduire les coûts de transformation de plus de 30% pour un seul lot et, associé à un processus de fermentation à haute densité, il est prévu de limiter le coût de production de protéines recombinantes par gramme à 1 / 2 de celui des méthodes traditionnelles. Sa traçabilité paramétrique conforme aux normes GMP et la stabilité de l'équipement fournissent un soutien essentiel au système de contrôle de la qualité de l'entreprise de fabrication de vaccins.

2. Dépistage à haut débit des antigènes Multi - pathogènes

Expression de protéines structurales de nombreux virus de l'élevage et de la volaille tels que la peste porcine classique, la conception modulaire de mini Pulser 399 permet une commutation rapide des souches hôtes (par exemple E. coli, Salmonella), combinée à un accessoire d'électrotranslation à plaques 96 puits (en option), permettant l'expression parallèle de Plusieurs antigènes avec un tamis primaire antigénique, réduisant la période expérimentale monotypique traditionnelle de 72H à 48h, accélérant considérablement le processus de développement de nouveaux vaccins.

3 Biologie synthétique et développement de réactifs de diagnostic

Dans les domaines de la distribution d'outils d'édition de gènes tels que le système crispr - cas9 pour l'importation de bactéries modifiées et la préparation de matières premières pour kits de diagnostic, les propriétés de transformation à faible dommage de ce dispositif peuvent améliorer l'expression soluble de protéines complexes, en particulier pour les protéines antigéniques riches en liaisons disulfures ou en sites de glycosylation. Par exemple, l'expression hautement active de la protéine VP2 dans les réactifs de diagnostic de typage du virus de la fièvre aphteuse peut augmenter la sensibilité de détection ELISA de 15%, fournissant aux laboratoires vétérinaires de base des outils de détection plus précis.

L'électroporateur économique Mini Pulser 399 de venead est l'outil idéal pour l'optimisation des systèmes d'expression procaryote grâce à sa capacité de transformation efficace, ses caractéristiques favorables aux cellules et son adaptabilité flexible. L'équipement fournit un support technique 7 × 24 heures sur 24 et des services gratuits d'optimisation des paramètres de la souche, qui ont été validés par des dizaines d'entreprises de médicaments vétérinaires et de laboratoires universitaires dans le pays, aidant ainsi les chercheurs à surmonter les goulots d'étranglement de l'expression des protéines recombinantes et à promouvoir la Mise à niveau technologique des vaccins vétérinaires et des réactifs de diagnostic.

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