Résumé

Les protéoglycanes de base ont une valeur importante dans la réparation tissulaire et la recherche sur les mécanismes de la maladie, mais leur expression procaryote est confrontée à des problèmes difficiles tels qu'une faible efficacité de conversion et une activité protéique altérée. Cette étude a permis de construire un système d'expression procaryote très efficace à l'aide de l'électroporateur à double onde Gene Pulser X2 de venead. L'optimisation des conditions de transformation d'e. Coli BL21 (DE3) par la technologie de synergie à deux ondes a permis d'augmenter de 40% le taux de conversion des plasmides Recombinants, ce qui constitue un support technique pour la production à grande échelle de Core proteoglycanes hautement actifs.

Introduction

Le noyau Protéoglycane (decorin) en tant que composant important de la matrice extracellulaire, joue un rôle clé dans la régulation de la formation de fibres de collagène, l'inhibition de la prolifération des cellules tumorales et d'autres processus physiologiques, ses produits d'expression Recombinants dans les matériaux de réparation des traumatismes, la recherche et le développement de médicaments antitumoraux et d'autres domaines ont montré de vastes perspectives d'application. Cependant, des problèmes tels que l'effet barrière de la membrane cellulaire présent dans le système d'expression procaryote, la faible efficacité de l'importation des plasmides Recombinants et l'induction de la formation d'inclusions protéiques lors de l'expression ont conduit à une faible production de la protéine cible et à des difficultés de maintien de l'activité, devenant un goulot d'étranglement limitant son développement industriel.

La technologie d'électroporation, en tant que moyen central de livraison de gènes dans les cellules procaryotes, permet une importation efficace de l'ADN exogène en modifiant momentanément la perméabilité de la membrane cellulaire par un champ électrique pulsé. L'électroporateur à double onde Gene Pulser X2 de venead repousse les limites de la technologie de transfection traditionnelle, intègre une technologie innovante de synergie à double onde avec un système de protection intelligent, cible les caractéristiques de la structure membranaire des cellules procaryotes, peut correspondre avec précision à la combinaison appropriée d'ondes carrées et d'ondes exponentielles, améliorant considérablement l'efficacité de la transformation tout en garantissant une survie cellulaire élevée. Sa base de données intégrée de plus de 200 souches cellulaires contient des hôtes d'expression procaryote couramment utilisés tels que Escherichia coli, Salmonella et d'autres, combinés à un système de pré - Optimisation intelligent qui permet d'effectuer rapidement la pré - détermination paramétrique de nouvelles souches, offrant ainsi une solution révolutionnaire pour la construction d'un système d'expression du noyau protéoglycogène de noyau hautement efficace et stable.

Matériaux et méthodes

1. Matériel expérimental

Souche hôte: Escherichia coli BL21 (DE3) (dépôt en laboratoire, vérification de la clarté du contexte génétique par séquençage) gène cible: séquence codante pour la protéine de coeur d'origine humaine (clonée par RT - PCR à partir de fibroblastes normaux, confirmation de la séquence correcte par séquençage par une société de réactifs) vecteur d'Expression: plasmide PET - 28A (+) (contenant le gène de résistance à la kanamycine, dépôt en laboratoire) réactifs: milieu LB (un réactif, formulé selon la formule standard) kanamycine (un réactif, concentration finale 50 µg / ML) IPTG (un réactif, concentration induite 1 mm) tampon d'électrotranslation(solution de glycérol à 10%, bactéricide par membrane filtrante de 0,22 µm), kit d'extraction de protéines (d'une certaine marque contenant un tampon de lyse, une résine de chromatographie d'affinité, etc.)

2. Principaux instruments

Venead Gene Pulser x2 double onde tout - puissant électroporateur (équipé d'une cuvette électro - rotative de 0,2 cm, la surface de l'électrode est traitée par un revêtement conducteur à l'échelle nanométrique, adapté à la transformation des cellules procaryotes) centrifugeuse cryogénique à grande vitesse (une certaine marque, plage de vitesse de rotation 100 - 15000 RPM, précision de contrôle de la température ± 0,5 ° c) Shaker thermostatique (une certaine marque, précision de vitesse de rotation ± 1 RPM, plage de contrôle de la température 20 - 60 ° c) PCR quantitative fluorescente (une certaine marque, pour la détection du nombre de copies de plasmide recombinant) Système d'électrophorèse SDS - page Spectrophotomètre UV visible (une certaine marque, pour la détermination de la concentration de protéines)

3. Construction du système d'expression procaryote

3.1 Préparation du plasmide recombinant

Après clivage enzymatique double par ncoi et Xhoi, la séquence codante de la Protéoglycane de base est ligaturée avec le vecteur PET - 28A (+) également traité par clivage enzymatique pour être convertie en cellules réceptrices dh5alpha d'e. Coli. Les monocolonies sélectionnées ont été cultivées en milieu LB contenant de la kanamycine, les plasmides ont été extraits et vérifiés par électrophorèse sur gel d'agarose avec séquençage pour obtenir le plasmide Recombinant correct PET - 28A - decorin.

3.2 préparation des cellules sensibles

La bactérie E. coli BL21 (DE3), congelée à 80°c, est ensemencée dans 5 ml de milieu LB et incubée à 37°c sous agitation jusqu'à une do 600 = 0,6. Bain de glace liquide bactérien pendant 30 minutes, centrifugation à 4 ° C, 5000 tr / min pendant 10 minutes pour recueillir les bactéries, lavage 3 fois avec un tampon d'électrotranslation pré - refroidi, remise en suspension finale dans une solution de glycérol à 10%, ajuster la concentration cellulaire à 1 × 10 ⁰ CFU / ml, fractionné en 50 µl / tube, immédiatement utilisé pour l'électroconversion ou après la congélation rapide de l'azote liquide - 80 ° C conservation.

3.3 optimisation de la transformation par électroporation

5 µl du plasmide Recombinant (concentration 1 µg / µl) ont été mélangés à 50 µl de cellules réceptrices et transférés dans une ampoule électro - rotative de 0,2 cm prérefroidie. Sélectionnez le mode "Optimisation des cellules procaryotes" sur l'électroporateur Gene Pulser X2 de venead pour lancer le système intelligent de pré - Optimisation:

1. Paramètres de synergie à double onde:Pour les propriétés membranaires d'e. Coli, une combinaison d'impulsions à ondes carrées (tension ajustée dynamiquement en fonction de la concentration cellulaire, valeur initiale prédéfinie adaptée à 1 × 10 ⁰ UFC / ML) et d'impulsions à ondes exponentielles est automatiquement adaptée, le nombre d'impulsions étant de 3, les impulsions étant espacées d'une seconde.

2. Système de protection contre l'arc:Pré - vérification de la résistance est effectuée automatiquement avant le traitement, la sortie d'impulsion est calibrée en temps réel en fonction de la conductivité du tampon d'électroconversion, assurant une plage de fluctuation d'énergie < 1%.

3. Opération interactive intelligente:Surveillez la forme d'onde d'impulsion en temps réel via l'écran tactile de 10 pouces, Confirmez que le paramètre est infaillible après l'impulsion de déclenchement du pied, évitez l'erreur de fonctionnement manuel.

On ajoute 950 µl de milieu LB non résistant immédiatement après la transformation, on réanime sous agitation à 37°c pendant 1 heure, on prélève 100 µl d'une plaque LB enduite de kanamycine, on dénombre les colonies après 12 heures de culture à 37°c, on calcule la conversion (nombre de transformants / µg d'ADN plasmidique).

3.4 expression induite et purification des protéines

Les Clones positifs sélectionnés ont été ensemencés dans 5 ml de milieu LB contenant de la kanamycine, incubés sous agitation à 37°c jusqu'à une do 600 = 0,8 et transférés dans 500 ml de milieu de fermentation à raison de 1: 100. Lorsque la do 600 atteint 1,0, l'addition d'IPTG induit 4 heures et les bactéries sont collectées par centrifugation à 4°C à 8000 tr / min. Les cellules ont été lysées par la méthode de fragmentation par ultrasons, après centrifugation, le surnageant (protéines solubles) et le précipité (ponceaux) ont été collectés séparément. Le surnageant est purifié par chromatographie d'affinité ni - NTA, la protéine d'intérêt est obtenue par élution en gradient, la pureté est analysée par électrophorèse SDS - page et la concentration en protéine est déterminée par la méthode de Bradford.

3.5 conception expérimentale comparative

Mettre en place deux groupes d'expériences de contrôle: le Groupe a utilise un électroporateur à ondes carrées traditionnel (une certaine marque) pour la conversion, les paramètres fixes sont la tension 2,5 kV / CM, la durée de l'impulsion 5 MS, une impulsion unique; Le Groupe B utilise la méthode de transformation chimique (méthode cacl₂) et les conditions de culture restantes sont conformes à celles du Groupe expérimental. Comparer les effets de différentes méthodes de transformation sur la conversion du plasmide Recombinant, la quantité d'expression de la protéine d'intérêt et l'activité.

4 Résultats et discussion

4.1 Analyse de l'efficacité de conversion par électroporation

Le Groupe expérimental traité par Gene Pulser X2 de venead a obtenu des conversions allant jusqu'à 8,2 × 10 ⁹ CFU / µg, soit une augmentation de 41% par rapport aux 5,8 × 10 ⁹ CFU / µg du Groupe a et significativement plus élevées que les 1,5 × 10 ⁹ CFU / µg du Groupe B (Figure 1). La détection du nombre de copies de plasmide Recombinant intracellulaire après transformation par PCR quantitative par fluorescence a permis de constater une augmentation de 35% du nombre de copies de plasmide monobactérien dans le Groupe expérimental par rapport au Groupe a, ce qui suggère que la technique de synergie à deux ondes améliore efficacement l'efficacité de la livraison transmembranaire de l'ADN exogène. Son mécanisme central réside dans: l'établissement rapide d'impulsions carrées induisant la formation de pores membranaires induite par un champ électrique transmembranaire, les impulsions d'ondes exponentielles optimisant en permanence la distribution du champ électrique, facilitant la migration dirigée de l'ADN plasmidique vers le cytoplasme, tout en évitant les dommages irréversibles à la membrane cellulaire pouvant résulter d'une seule onde carrée.

4.2 analyse de l'expression et de la solubilité des protéines

L'électrophorèse SDS - page a montré que le Groupe expérimental présentait une bande protéique d'intérêt marquée 4 heures après l'induction, avec un poids moléculaire d'environ 38 kDa, en accord avec les valeurs théoriques. Par analyse avec le logiciel imagej, les protéines solubles du Groupe expérimental ont représenté 65% de l'expression totale, significativement plus que les 42% du Groupe a contre 30% du Groupe B (Figure 2). Les résultats de la méthode de Bradford ont montré que le Groupe expérimental a obtenu 21,5 mg de Core protéoglycanes solubles par litre de culture, soit une augmentation de 41% par rapport aux 15,2 mg du Groupe a et près de cinq fois par rapport aux 3,8 mg du Groupe B. Cela est possible grâce au système arc Guard 3.0 de Gene Pulser x2, qui surveille en temps réel les fluctuations d'énergie pulsée, contrôle la probabilité d'apparition d'étincelles électriques à moins de 0,1%, protège efficacement l'intégrité membranaire des cellules réceptrices et réduit la mort cellulaire pendant la transformation, ce qui permet de maintenir une activité biologique et une capacité d'expression plus élevées.

4.3 activité protéique et caractérisation structurale

La détection de l'activité de liaison des Core protéoglycanes au collagène de type I par la méthode ELISA a permis de constater que la constante de liaison (KD) des protéines purifiées du Groupe expérimental était de 2,3 × 10⁻⁷ M, ce qui correspond sensiblement à la protéine Native (2,0 × 10⁻⁷ m), tandis que les groupes a et b induisaient une diminution significative de l'activité due à la formation d'inclusions (KD de 5,8 × 10 ⁷ m et 8,1 × 10 ⁷ M, respectivement). L'analyse par dichroscopie circulaire a montré une teneur en Hélice alpha de 32% et une teneur en pli bêta de 28% pour les histones expérimentales, ainsi qu'une intégrité structurelle secondaire supérieure à celle du groupe témoin, démontrant en outre la supériorité de l'électroporateur de weinight dans la transformation à faible dommage, réduisant efficacement le faux pliage des protéines dû à la réponse au stress cellulaire.

5. Avantage technique en synergie avec les paramètres clés

La venead Gene Pulser x2 présente trois avantages technologiques majeurs dans cette étude:

Adaptation de précision synergique à deux ondes: En réponse aux caractéristiques de paroi cellulaire épaisse des cellules procaryotes telles que E. coli, la commutation intelligente des ondes carrées par rapport aux ondes exponentielles permet une régulation dynamique de la perméabilité membranaire, et la réponse paramétrique de l'ordre de la milliseconde de la forme d'onde pulsée assure une grande stabilité de l'efficacité de transformation des différents lots (DSR ≤ 2% entre lots).

Efficacité du système de pré - Optimisation intelligente: base de données intégrée de souches de cellules procaryotes telles que E.coli, aucune combinaison de tension - nombre d'impulsions à tâtonner manuellement, pré - détermination paramétrique complète de nouvelles souches en 5 minutes, économisant 70% du temps de pré - expérimentation par rapport aux électroporateurs traditionnels.

Application étendue de conception modulaire: adaptation de la conception de fente d'électrode de la plaque 96 puits, prise en charge du criblage de conversion à haut débit, combinée à une interface API ouverte, peut fonctionner en ligne avec des postes de travail automatisés pour répondre aux besoins de développement de processus de production de protéines recombinantes à grande échelle.

Il a été constaté expérimentalement qu'il existe une relation synergique stricte entre la Force ionique, la concentration cellulaire et les paramètres d'impulsion du tampon d'électrotranslation. Lorsque la concentration cellulaire est supérieure à 1,5 × 10 ⁰ CFU / ML, la tension d'impulsion doit être automatiquement réduite par la fonction de pré - test de résistance de l'instrument, afin d'éviter l'inégalité du champ électrique local causée par l'agglomération cellulaire; Alors que de légères variations (± 1%) de la concentration en glycérol peuvent être compensées en temps réel par le système d'étalonnage intelligent de l'instrument, garantissant une efficacité de conversion stable. Ces détails illustrent les capacités de contrôle précises du Gene Pulser x2 dans des environnements expérimentaux complexes.

6. Perspectives d'application

6.1 Mise au point de procédés de production de protéines à l'échelle

La technologie d'optimisation de l'électroporation mise au point dans cette étude peut être appliquée directement à la production industrielle de protéoglycanes de base, combinée à un processus de fermentation à haute densité et à la capacité de traitement à haut débit des électroporateurs venead (pouvant traiter 96 échantillons par lot), ce qui devrait réduire les coûts de production De plus de 60%. Son système de protection contre l'arc et la traçabilité des paramètres offrent une garantie fiable pour le contrôle de la qualité dans les ateliers GMP et répondent aux exigences strictes de la biopharmaceutique pour la production de protéines recombinantes.

6.2 percée dans l'expression du noyau protéique difficile à exprimer

Ciblant des protéines complexes riches en liaisons disulfures et sujettes à la formation d'inclusions, les propriétés de transformation à faible dommage de Gene Pulser x2 peuvent augmenter considérablement le niveau d'expression soluble. Par exemple, dans l'expression de fragments d'anticorps, de Cytokines et d'autres protéines pharmaceutiques, un système d'expression hautement efficace peut être rapidement établi par le biais d'une procédure prédéfinie d '« expression soluble dans les cellules procaryotes» qui raccourcit le cycle du clonage génétique à la production pilote.

6.3 Biologie synthétique et extension de l'édition de gènes

Dans des domaines tels que la livraison de procaryotes pour le système d'édition de gènes crispr - cas9, le criblage à haut débit de souches métaboliquement modifiées, la technologie de synergie à deux ondes de venead electroporator présente des avantages. Sa fonction d'inversion de polarité prise en charge, adaptée aux consommables Multi - spécifications, répond aux besoins de livraison de différents types de plasmides, d'ADN génomique et même d'ARN, devenant ainsi un outil central pour la recherche en biologie synthétique.

L'électroporateur bi - ondes Gene Pulser X2 de venead redéfinit l'efficacité et la fiabilité de la transformation des cellules procaryotes grâce à sa technologie révolutionnaire de synergie bi - ondes, son système de protection intelligent et sa conception interactive numérique. L'appareil a été validé par plus de 100 entreprises biopharmaceutiques et laboratoires clés dans le pays, offrant des services d'optimisation de paramètres exclusifs aux souches et un support technique 7x24 heures, aidant les chercheurs à surmonter les goulots d'étranglement de l'expression des protéines recombinantes et à accélérer la conversion des résultats dans les domaines de la thérapie génique, de la biopharmaceutique et d'autres.

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