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Aujourd'hui, nous examinons Pourquoi choisir une colonne monolithique est préférable à une colonne de remplissage de particules poreuses traditionnelle lors de l'optimisation des acides nucléiques?. Mettez - en un d'abordL'animation du principe de l'acide nucléique purifié de la colonne entière est faite, l'image est vivante et facile à comprendre, de nombreux points clés de cet article sont représentés dans l'animation. Si vous avez fini de regarder l'animation et que vous n'avez aucun intérêt, il n'est pas nécessaire de regarder le texte ci - dessous, car l'article est trop long et laborieux

= colonne de remplissage de particules poreuses et colonne monolithique

Concepts fondamentaux de diffusion et de convection

Transfert de diffusion en milieu poreux

En chromatographie, la distance entre la phase stationnaire et la phase mobile est très faible, de l'ordre du nanomètre au micromètre, mais elle est très importante pour les milieux poreux qui dépendent de la diffusion pour mettre en oeuvre le processus de transfert de masse biomoléculaire. Dans une colonne de chromatographie chargée de particules poreuses,La diffusion est la façon dont les molécules de soluté entrent et sortent de l'intérieur des pores des particules（Parce que le débit à l'intérieur de l'alésage est 0),Plus la molécule de soluté est grande, plus la diffusion est lente, alors plus la capacité de liaison dynamique du milieu poreux en phase stationnaire est faible.

En outre,En chromatographie de particules poreuses, l'interaction du transfert convectif et du transfert diffus entraîne également une diminution de la capacité de liaison du milieu en phase stationnaire.il a un temps très court pour diffuser à l'intérieur des particules poreuses avant que la convection ne lave les macromolécules biologiques. Plus le débit est rapide, plus le temps de fenêtre sera court, moins le soluté peut diffuser à l'intérieur des pores des particules, déjà balayé par convection, de sorte que la capacité de liaison des particules sera faible. La diminution de la capacité de liaison du milieu solide chromatographique due à la diminution du coefficient de diffusion des macromolécules biologiques peut être compensée par une diminution du débit. En résumé,En milieu granulaire poreux, la capacité de liaison de la phase stationnaire est inversement proportionnelle au débit et à la taille du soluté- Oui.

Un transfert de masse hétérogène se produit dans les particules poreuses et, si le débit est trop rapide, un processus de diffusion lent ne permet pas d'équilibrer la concentration des molécules de soluté entre l'intérieur des pores des particules et les vides des particules.

Influence du débit sur la capacité de liaison dynamique du milieu à phase fixe. Gauche: l'efficacité de transfert de masse diffusée diminue en raison de l'augmentation du débit et la capacité de liaison du milieu poreux diminue avec l'augmentation du débit. Image de droite: dans la colonne monolithique se trouve le transfert convectif, dont la capacité de liaison du milieu solide n'est pas affectée par le débit. Remarque: la courbe ici est appelée Breakthrough curve, en ordonnées se référant à la quantité de protéines perdues en raison de la surcharge en protéines totales et en abscisses se référant à la quantité de protéines chargées par ml de matrice (mg protein Load / volume de médicament (mg / ML))

Différence de taille des pores et de surface de liaison du milieu en phase solide

Les substances macromoléculaires, telles que les acides nucléiques, ont une capacité de liaison plus élevée dans la colonne globale, qui est également la mêmeLa colonne monolithique offre une plus grande surface de liaison aux macromolécules biologiques.Pour la colonne monolithique, toute la surface du tuyau interne peut être combinée par des molécules de soluté.

Dans une colonne de chromatographie en milieu poreux, les molécules du soluté peuvent accéder sans obstacle à toute la surface extérieure des particules, mais la surface extérieure ne représente que 2% de la surface intérieure des pores des particules. Seule une plus grande taille de pores de particules peut contenir de plus grandes molécules de soluté, mais,Pour que les molécules de soluté se lient sans restriction à la surface interne de la taille des pores des particules, il faut que la taille moyenne des pores des particules dépasse dix fois celle des molécules de soluté.Beaucoup. Il est très rare que les milieux poreux aient des tailles de pores supérieures à 100 nm, car une porosité excessive diminue la stabilité des particules.

La taille du soluté et la taille des pores des particules affectent sérieusement la capacité de liaison du milieu

Adsorption de l'ADN plasmidique à la surface du milieu

Par conséquent,Du point de vue de la qualité combinée du diamètre des particules et de l'unité de surface du milieu,Colonne intégrale plus adaptée aux solutés macromoléculairesParce qu'il peut fournir une plus grande capacité de liaison de médias. EtPour les petites molécules（Les protéines) etPour ainsi dire, les médias poreux ont une capacité de liaison plus efficace- Oui.

Différences dans la capacité de liaison des molécules de solutés de différentes tailles dans la colonne monolithique et le milieu poreux

écoulement laminaire dans la colonne monolithique et turbulence en milieu poreuxEn raison de la présence de forces de frottement, le débit de surface du milieu est de 0 et plus on s'éloigne de la surface du milieu, plus la vitesse du flux laminaire est rapide, provoquant une dispersion du flux laminaire.

La dispersion est l'ennemi de la résolution chromatographique- Oui.Dans la colonne monolithique, seule une faible dispersion laminaire est présente, de telle sorte qu'il s'agisse de molécules solutées de différentes tailles, à différents débits,Toutes avec une bonne résolution chromatographique. Au contraire,La dispersion produite en milieu poreux est d'origine plus importante et plus grave, principalementComprend diffusion inefficace et dispersion par vortex- Oui.Avec l'augmentation du débit, les molécules du soluté augmentent, plus la diffusion est lente, plus la dispersion totale est importante,Plus la résolution est basse- Oui.

Différents milieux, différents débits, provoquent différents types de dispersion qui affectent la résolution chromatographique.La résolution de la colonne globale n'est pas affectée par les molécules de soluté et le débit

Force de cisaillement Vortex générée par l'entrefer des particules poreuses

résumé

La colonne monolithique est utilisée comme phase stationnaire chromatographique de génération 4, présentant des avantages particuliers par rapport aux milieux poreux traditionnels en termes de séparation rapide des biomacromolécules purifiées, les propriétés de purification de la colonne monolithique étant déterminées par des caractéristiques intrinsèques, un mode de transfert de masse par convection et une capacité de liaison efficace (en particulier pour les biomacromolécules); Haute résolution indépendamment de la taille du soluté, de la vitesse du fluide; Aucune restriction de taille de pore, large surface liable; Faible force de cisaillement. L'obtention de molécules d'ADN et d'ARN plasmidiques de haute qualité et de haute pureté est une source essentielle de processus pour les vaccins à ADN ou à ARN. En raison de la grande masse et le diamètre, un très bon choix lors du développement de plasmides ADN ou ARN processus de purification moléculaire, plus * performance colonne globale.