Kit CCK - 8 (détection de la prolifération cellulaire et de la toxicité)

Le kit de comptage cellulaire - 8 ou CCK - 8, une alternative à la méthode MTT, est un kit de détection rapide et très sensible largement utilisé pour la prolifération cellulaire et la Cytotoxicité, basé sur wst (sel de tétrazole soluble dans l'eau, nom chimique: 2 - (2 - méthoxy - 4 - nitrophényl) - 3 - (4 - nitrophényl) - 5 - (2,4 - disulfophényl) - 2H - tétrazole monosodique). Il peut être utilisé pour le dépistage de médicaments, la détermination de la prolifération cellulaire, la détermination de la Cytotoxicité, la sensibilité aux médicaments tumoraux et d'autres tests.

Instructions d'utilisation:
I. faire une courbe standard (lors de la détermination du nombre spécifique de cellules (lors de la détermination du nombre spécifique de cellules)
1, compter d'abord le nombre de cellules dans la suspension cellulaire préparée avec une plaque de comptage cellulaire, puis ensemencer les cellules.
2, dilué dans un gradient de concentration cellulaire en proportion égale avec le milieu de culture, généralement faire 3 - 5 gradients de concentration cellulaire, chaque groupe de 3 - 6 pores.
3, après l'inoculation de la culture à la paroi cellulaire, puis l'ajout du réactif CCK - 8 après un certain temps de culture pour déterminer la valeur OD, faire une courbe standard avec le nombre de cellules en abscisse (axe X), la valeur od en ordonnée (axe y). Le nombre de cellules d'un échantillon inconnu peut être déterminé à partir de cette courbe standard (l'essai de cette courbe standard suppose que les conditions de l'expérience soient cohérentes, ce qui facilite la détermination du nombre de cellules inoculées et du temps de culture après l'ajout de CCK - 8). ) et

II. Détection de l'activité cellulaire

1, ensemencer la suspension cellulaire (100 µl / puits) dans des plaques de 96 puits. Les plaques de culture sont préculturées dans un incubateur (à 37°c, 5% de CO 2).

Ajoutez 10 µl de solution de CCK - 8 à chaque puits (Veillez à ne pas créer de bulles dans les puits, elles affecteront la lecture des valeurs de do).

3, incuber la plaque de culture dans l'incubateur pendant 1 - 4 heures.

4, détermination de l'Absorbance à 450 nm avec un étalon enzymatique.

Si la valeur de do n'est pas déterminée temporairement, en vue d'une détermination ultérieure, vous pouvez ajouter 10 µl d'une solution de HCl 0,1 m ou de SDS à 1% (P / v) dans chaque puits et protéger la plaque de culture de la lumière à la température ambiante. L'Absorbance ne change pas pendant 24 heures.

Iii. Valeur ajoutée cellulaire - détection de la toxicité

1, configurer 100 µl de suspension cellulaire dans une plaque de 96 puits. Les plaques de culture sont préculturées dans un incubateur pendant 24 heures (à 37°c, 5% de CO 2).

Ajouter 10 µl de la substance à mesurer à différentes concentrations à la plaque de culture. Incuber dans l'incubateur pendant une période appropriée (par exemple: 6, 12, 24 ou 48 heures).

Ajoutez 10 µl de solution de CCK - 8 à chaque puits (Veillez à ne pas créer de bulles dans les puits, elles affecteront la lecture des valeurs de do). Si la substance à tester est oxydante ou réductrice, le milieu frais peut être remplacé avant l'ajout de CCK - 8 (le milieu est éliminé et les cellules sont lavées deux fois avec le milieu, puis un nouveau milieu est ajouté), l'effet du médicament étant éliminé.

4, incuber la plaque de culture dans l'incubateur pendant 1 - 4 heures.

5, détermination de l'Absorbance à 450 nm avec un étalon enzymatique.

Si la valeur de do n'est pas déterminée temporairement, en vue d'une détermination ultérieure, vous pouvez ajouter 10 µl d'une solution de HCl 0,1 m ou de SDS à 1% (P / v) dans chaque puits et protéger la plaque de culture de la lumière à la température ambiante. L'Absorbance ne change pas pendant 24 heures.

Calcul de vitalité:.

Viabilité cellulaire (%) = [A (dosage) - A (blanc)] / [A (dosage) - A (blanc)] × 100

A (dosage): Absorbance des pores avec cellules, solution de CCK - 8 et solution pharmaceutique

A (blanc): Absorbance des pores avec milieu de culture et solution de CCK - 8 sans cellules

A (0 dosage): Absorbance des pores avec cellules, solution de CCK - 8 sans solution pharmaceutique

Viabilité cellulaire: viabilité cellulaire proliférative ou viabilité cytotoxique

Précautions:

① il est recommandé de faire d'abord plusieurs puits pour tâtonner le nombre de cellules inoculées et le temps de culture après l'ajout du réactif CCK - 8.

② les globules blancs peuvent nécessiter une culture plus longue.

③ lors de l'utilisation de plaques standard de 96 puits, l'inoculation minimale des cellules plaquées est d'au moins 1 000 cellules / puits (100 µl de milieu). La sensibilité lors de la détection des globules blancs est relativement faible, de sorte que l'inoculation recommandée n'est pas inférieure à 2500 / puits (100 µl de milieu). Si vous souhaitez utiliser des expériences de plaques 24 ou 6 puits, calculez d'abord la quantité d'inoculum correspondante par puits et ajoutez la solution de CCK - 8 à 10% du volume total du milieu par puits.

④ s'il n'y a pas de filtre de 450 nm, vous pouvez utiliser un filtre avec une Absorbance comprise entre 430 et 490 nm, mais la sensibilité de détection de 450 nm est la plus élevée.

⑤ l'Absorbance du rouge de phénol dans le milieu de culture peut, au moment du calcul, être éliminée en déduisant l'Absorbance du fond local dans les puits vides, de sorte qu'il n'y a pas d'impact sur la détection.