Fluo - 8 am, sonde de fluorescence à ions Calcium Cell permeant

Fluo - 8 am, sonde de fluorescence à ions Calcium Cell permeant

Présentation du produit

Fluo-8（Fluo-2 Medium Affinity）， Est actuellement la sonde fluorescente Ca2 + à longueur d'onde d'excitation visible la plus brillante, qui Fluorescent deux fois plus intensément que fluo - 4 et quatre fois plus intensément que fluo - 3. Fluo - 8 a une affinité Ca2 + modérée, presque proche Fluo-3，Fluo-4（Fluo-3: Kd=0.4μM、Fluo-4: Kd=0.36μM、Fluo-4: Kd= 0.389μM）， Presque identique à fluo - 3 et fluo - 4. Le fluo - 8 maintient non seulement les propriétés de détection spectrale pratiques du fluo - 3 et du fluo - 4, avec une longueur d'onde maximale d'excitation de 490 nm et une longueur d'onde maximale d'émission de 514 nm lorsqu'il est combiné au Ca2 +, mais il a également une charge cellulaire améliorée et une réponse Au Ca2 +. La charge de fluo - 8 est faiblement dépendante de la température et l'incubation est bien colorée à la température ambiante ou à 37 ° C, contrairement à fluo - 3, qui nécessite strictement une incubation à 37 ° C, une caractéristique qui le rend plus approprié pour les expériences de dépistage à haut débit HTS. Fluo - 8 est largement utilisé et compatible avec de nombreuses lignées cellulaires et des échantillons ciblés, sans interférence avec les signaux du Ligand ou de la cible elle - même.

Fluo - 8 peut détecter les changements dans les niveaux d'ions Calcium intracellulaires par microscopie confocale au laser, cytométrie en flux, fluoroscopie, Microscopie à fluorescence, etc. Fluo - 8, AM est un dérivé de l'acétylméthylester de fluo - 8 qui a la perméabilité de la membrane cellulaire et peut facilement entrer dans les cellules avec une simple culture. Une fois à l'intérieur de la cellule, c'est - à - dire cisaillé par sa lactonase, le fluo - 8 non perméable à la membrane est emprisonné à l'intérieur de la cellule pour remplir les fonctions physiologiques correspondantes.

Ce produit est sous forme de poudre lyophilisée dans un petit paquet de 50 µg pour la détection des niveaux intracellulaires de Ca2 +, la concentration recommandée est de 1 à 5 µm.

Fluo - 8 am, sonde de fluorescence à ions Calcium Cell permeant

Caractéristiques essentielles

Nom synonyme: Fluo-8, AM

Formule moléculaireC :50H50N2O23

Poids moléculaire: 1046.9316

Solubilité: soluble dans le DMSO (1 - 5 mm)

Ex/Em: 490 / 514 nm (liaison Ca2 +);

Conditions de stockage: mise à - 20 ℃ conservation à sec, 1 an d'efficacité.

Fluo - 8 am, sonde de fluorescence à ions Calcium Cell permeant

mode d'emploi

Préparation du réactif a

1) Préparation de la solution mère pluronic F - 127: peser 100 mg de poudre de pluronic F - 127 (réf.: Cat. No. Fs0432) Ajouter 500 µl de DMSO pour former une solution mère de 20% (W / v). Le processus de dissolution doit être chauffé à 40 - 50 ℃ pendant 20 - 30 min. La température ambiante de la solution est conservée sans réfrigération. S'il y a un dégagement cristallin, la dissolution peut être réchauffée sans affecter l'utilisation.

2）HHBS BUFFER(1X Hank’s Balanced Salt Solution with 20mM HEPES buffer,pH7.3) Ou autre tampon physiologique

B Étapes opérationnelles

1) dissoudre le fluo - 8 avec du DMSO anhydre, AM formulé dans un liquide de stockage de 1 à 5 mm ou prendre le liquide de stockage fluo - 8, AM déjà préparé à température ambiante. (exemple: pour préparer une solution mère de 4 mm, ajouter 11,9 µl de DMSO anhydre à 50 µg de fluo - 8, AM).

2) diluer avec hhbs ou autre tampon physiologique fluo - 8, AM + DMSO Storage dans un liquide de travail de 1 à 10 µm, en ajoutant au préalable la bonne quantité de solution de pluronic F - 127 à 20% pour obtenir une concentration finale de 0,02%.

[Note (1)]: fluo - 8, AM applications dans la plupart des cellules avec une concentration de charge recommandée de 4 - 5 µm, les concentrations spécifiques d'utilisation doivent être optimisées en fonction des exigences expérimentales. Pour éviter la Cytotoxicité causée par une surcharge, il est recommandé d'utiliser zui faible concentration de sonde autant que possible sur la base des résultats obtenus.

[Note (2)]: fluo - 8, AM liquide de travail doit être utilisé maintenant pour éviter la congélation répétée.

[Note (3)]: pluronic F - 127 empêche fluo - 8, AM de s'agglutiner en solution et incite la sonde à mieux pénétrer dans la cellule. Mais pluronic F - 127 réduit la stabilité du fluo - 8, AM, il est donc recommandé de ne l'ajouter qu'au moment de la formulation du liquide de travail et de ne pas ajouter de liquide de stockage pour une conservation à long terme.

3) [facultatif] si les cellules contiennent un transporteur d'anions organiques, il peut être nécessaire d'ajouter du prosulfosu (probenecid, 1 - 2,5 mm) ou de la sulfinpyrazone (Sulfinpyrazone, 0,1 - 0,25 mm) dans le milieu de culture cellulaire pour réduire la fuite de la sonde de désestérification.

[Note (1)]: le proposulfosu ou le sulfapyrone est assez basique, il est donc nécessaire de réajuster le pH après l'ajout du milieu de culture.

4) Ajouter le fluide de travail fluo - 8, AM préparé aux cellules, la quantité ajoutée étant fonction de la couverture des cellules. 37 ℃ ou incuber à température ambiante pendant 20 - 60 min.

[Note (1)]: en ce qui concerne le temps d'incubation, si le premier ci pour faire l'expérience ne peut pas être sûr, il est recommandé d'incuber d'abord pendant 30 min, voir l'effet de fluorescence; Si les cellules meurent plus, raccourcir le temps de manière appropriée; Si l'intensité de fluorescence est trop faible, prolonger le temps de manière appropriée.

[Note (2)]: réduire la température de chargement de la sonde peut réduire le phénomène de compartimentation de la sonde.

5) aspirer le liquide de travail de coloration et le remplacer par du hhbs ou un autre tampon physiologique (si nécessaire, en utilisant un tampon contenant un inhibiteur du transporteur tel que l'acide propanesulfonique 2,5 mm) pour éliminer l'excès de sonde.

6) Détection avec des instruments appropriés tels que la confocalisation laser, cytométrie de flux, fluorescence enzymatique, etc., longueur d'onde EX / em = 490 / 520 nm.

[Note (1)]: fluo - 8, AM après son entrée dans la cellule, est dégradé par estérase pour former fluo - 8, qui n'est pas retenu dans le cytoplasme sous forme de liaison valentielle. Par conséquent, les cellules vivantes chargées de colorant ne peuvent pas être immobilisées avant d'être testées au niveau du Ca2 +.

Précautions

1) colorant Fluorescent uniforme dans le problème de trempe, s'il vous plaît essayer de prêter attention à l'évitement de la lumière pour ralentir la trempe fluorescente.

2) l'acétoxyméthyl ester (AM) est facile à absorber l'humidité, s'il vous plaît ouvrir après le retrait du réfrigérateur dans un environnement sec à la température ambiante. En raison des traces de réactifs, s'il vous plaît centrifuger brièvement avant l'ouverture pour garantir que la poudre tombe au fond du tube.

3) fluo - 8, AM dans 4 ℃, bain de glace et d'autres conditions de température inférieure se solidifiera et collera au fond du tube de centrifugation, ou à l'intérieur de la paroi du tube ou du couvercle du tube, peut être utilisé après une période d'incubation de 20 - 25 ℃ à la dissolution totale.

4) fluo - 8, AM première utilisation, le liquide de stockage recommandé est maintenant utilisé, divisé en une seule dose, strictement faire ≤ - 20 ℃ scellé sec et congelé pour empêcher l'humidité. Pour garantir de bons résultats expérimentaux, essayez de l'utiliser dans un court laps de temps.

5) pour votre sécurité et votre santé, Veuillez porter des vêtements expérimentaux et utiliser des gants jetables.