Fluorimètre à balayage différentiel à haut débit supr - DSF

Stabilité des protéines

La stabilité des protéines est l'un des principaux attributs qualitatifs des médicaments biotechnologiques, qui déterminent leur efficacité, leur faisabilité de fabrication, leur sécurité et leur durée de conservation. La stabilité structurelle avancée des protéines garantit que les protéines restent actives et sûres tout au long de leur durée de vie.

Les études de stabilité ont été utilisées pour confirmer la stabilité de la structure hos (High Order structure) dans différentes conditions, telles que la température, le pH, la composition des excipients et la durée de stockage, afin de déterminer les conditions de stockage et de transport appropriées. Dans le même temps, les organismes de réglementation tels que la FDA, l'EMA, etc. exigent également des données de stabilité étendues avant d'autoriser l'approbation de l'utilisation d'un médicament biologique. Par conséquent, la compréhension et l'assurance de la stabilité structurelle avancée des médicaments à base de protéines thérapeutiques sont nécessaires pour que les entreprises biopharmaceutiques développent des médicaments sûrs et efficaces, et les chercheurs doivent analyser et évaluer la stabilité structurelle avancée des protéines à plusieurs étapes de la R & D et de la production.

Méthodes analytiques courantes pour la stabilité des protéines

L'analyse de la stabilité des protéines est généralement étudiée en utilisant les méthodes suivantes:

Méthodes biochimiques

Dichroïsme circulaire (CD, Circular Dichroism Spectroscopy)

Calorimétrie différentielle à balayage (DSC)

Technique de PCR quantitative (QPCR) (DSF Fluorescent exogène)

Méthodes de diffusion dynamique de la lumière (DLS) vs diffusion statique de la lumière (SLS)

La calorimétrie différentielle à balayage (DSC) est souvent considérée comme la solution la plus importante pour l'analyse de la stabilité des protéines, mais l'utilisation de DSC dans le dépistage de médicaments et le développement précoce est quelque peu limitée en raison du besoin d'analyse rapide d'un grand nombre d'échantillons stockés sur des microplaques telles que des plaques 96 ou 384 puits. Par conséquent, la DSF (méthode de fluorescence endogène) est devenue une solution populaire et rentable.

La DSF (méthode de fluorescence endogène) ne nécessite aucun marquage de l'échantillon à tester, ni l'utilisation de sondes fluorescentes, ce qui permet de mesurer rapidement des microplaques d'échantillon entières et de fournir des données à haut débit pour faciliter le dépistage des candidats d'échantillon et des ingrédients de formulation.

La méthode DSF examine rapidement un grand nombre d'échantillons, ce qui améliore considérablement l'efficacité du dépistage des médicaments, de l'analyse de la pharmacogenèse et de la vérification orthogonale des résultats avec la technologie DSC. Pour de nombreux médicaments biotechnologiques, l'utilisation de la méthode DSF en tant que dépistage rapide et massif, l'utilisation de la technologie DSC pour vérifier orthogonalement les résultats du dépistage précoce du DSF, est un programme efficace pour le dépistage et le développement de médicaments.

Principes de la technologie DSF:

La fluorescence différentielle à balayage (DSF) est une technique biophysique rentable et facile à utiliser qui détermine la température de transition dénaturante d'une protéine (température de transition thermique TM ou valeur de dénaturation chimique cm) en détectant les variations correspondantes du spectre d'émission de fluorescence lorsque la température augmente ou lorsque l'agent dénaturant est présent.

L'étude a révélé que les acides aminés cycliques aromatiques dans les molécules de protéines subissent un déplacement du spectre d'émission maximal de la fluorescence endogène qu'ils sont excités lorsqu'ils sont dans des microenvironnements de polarités différentes, comme dans des environnements hydrophobes ou hydrophiles. La fluorescence endogène dans les protéines provient principalement des acides aminés cycliques aromatiques tels que le tryptophane (TRP), la phénylalanine (phe) et la tyrosine (Tyr), où la fluorescence endogène est forte avec le tryptophane.

Prenons par example le tryptophane dont la longueur d'onde maximale d'émission de fluorescence endogène est de l'ordre de 330 nm dans le microenvironnement nucléaire hydrophobe des protéines, alors que la longueur d'onde maximale d'émission de fluorescence endogène du tryptophane apparaît de l'ordre de 350 nm dans le microenvironnement polaire hydrophile. La dénaturation thermique ou chimique d'une protéine entraîne généralement une modification de la polarité du microenvironnement autour du résidu tryptophane, ce qui expose progressivement le tryptophane, normalement enveloppé dans le noyau hydrophobe de la protéine, à un environnement hydrophile, ce qui entraîne un décalage vers le rouge de la longueur d'onde maximale d'émission de fluorescence endogène, C'est - à - dire vers une plus grande région de longueur d'onde.

Cette méthode de surveillance des variations de fluorescence endogène du tryptophane ne nécessite pas de sonde ou d'étiquette fluorescente, évitant ainsi les résultats faussement positifs tels que la fluorescence de fond et l'adsorption non spécifique dans le DSF Fluorescent exogène traditionnel.

Lorsqu'une protéine se déplie en raison d'une dénaturation thermique ou chimique (par exemple, chlorhydrate de Guanidine, urée, etc.), la mesure de la fluorescence endogène en fonction de la température ou de la dénaturation permet d'étudier le déroulement de la protéine. Les données de ces variations peuvent être utilisées pour générer des courbes de fusion et acquérir des valeurs de température de transition thermique apparente TM, Tonset、 La variation enthalpique de Van der Waals (Δh), l'énergie libre de Gibbs (Δg), les valeurs de cm de la dénaturation chimique, etc. sont utilisées pour évaluer et prédire la stabilité des protéines.

Alors que les DSF classiques utilisent souvent la méthode du rapport 350 / 330 pour l'analyse des données, supr - DSF offre une variété de méthodes d'analyse, en plus de la méthode du rapport, supr - DSF fournit également BCM (barycentric mean, Mass Centric mean) qui peut donner un meilleur rapport signal / bruit que la méthode du rapport 350 / 330, tout en favorisant l'analyse d'échantillons de protéines à faible concentration.

Fluorimètre à balayage différentiel à haut débit supr - DSFPrincipales caractéristiques du système:

Avec microplaque 384 standard, aucun consommable spécial et capillaire requis

Criblage à haut débit, peut être complété dans un processus de réchauffement (60 - 80 minutes)

Test d'une microplaque 384 monobloc utilisant la fluorescence endogène, sans colorant ni étiquette, compatible avec les systèmes biologiques courants excitation LED UV avec détection à spectre complet

Seulement besoin d'échantillon de 10 - 30μl, concentration d'échantillon 0.05 ~ 250mg / ml

Obtenez les paramètres clés: tonset, TM, ΔΗ, Δg, cm et affinité, etc.

Fournir une qualité et une répétabilité rigoureuses des données

Fluorimètre à balayage différentiel à haut débit supr - DSFApplication du système:

Le système supr - DSF est largement utilisé dans de nombreux domaines tels que la recherche fondamentale en sciences de la vie et la recherche et le développement de médicaments:

Dépistage des mutants accélérés

Dépistage et optimisation des formulations et pré - formulations

Criblage des conditions de cristallisation des protéines

Évaluation de la cohérence interbatch

Évaluation de la biosimilarité

Études accélérées de stress et de dégradation forcée

Analyse des changements conformationnels induits par la liaison

Évaluation de la retouche post - traduction

Analyse thermostatique et de stabilité chimique

Caractéristiques techniques du système supr - DSF:

Cas d'application typique - -Dépistage des mutants accélérés

16 échantillons ont été comparés et criblés à l'aide de supr - DSF, dont 1 protéine de type sauvage (WT) et 15 mutants monosites. En 1,5 heure, l'instrument DSF a généré des courbes de fusion de haute qualité pour 48 échantillons (3 répétitions par groupe) (les données peuvent être générées jusqu'à 384 puits dans le même temps). L'ajustement des données avec un modèle permet d'obtenir des valeurs de température de fusion TM et de trier et filtrer la stabilité.

Les courbes de fusion de 3 mutants (9, 13 et 14) sont décalées vers la gauche par rapport à WT (bleu), comme représenté sur la figure 1, illustrant leur stabilité protéique réduite; La stabilité des 12 mutants restants a été améliorée. Parmi ceux - ci, l'amélioration de la stabilité est maximale pour les mutants 1, 8 et 12.

La figure 2 montre les courbes de fusion de plusieurs échantillons représentatifs et permet de constater que certaines protéines ont subi un seul processus de transition thermique (protéine WT vs mutants 7 et 8), tandis que d'autres (mutants 1 et 14) montrent clairement un processus de transition thermique en deux segments, c'est - à - dire avec deux points d'inflexion sur la courbe de fusion. Les données fournies par supr - DSF peuvent aider les chercheurs à sélectionner des candidats prometteurs pour une étude approfondie.

Analyse précise de la région FAB du mumab

Les données de fluorescence à balayage différentiel du nistmab (NIST Standard for monomab) ont été obtenues à l'aide de supr - DSF et les résultats ont été comparés à ceux obtenus par calorimétrie à balayage différentiel (DSC). Le supr - DSF peut analyser les trois domaines du nistmab: CH2 (69 °C), CH3 (83 °C) et la région FAB (94 °C). Avec une température de balayage maximale de 105 °C, le supr - DSF peut mesurer avec précision la température de fusion de la région FAB exceptionnellement stable, alors que les températures de balayage maximales des autres plates - formes DSF ne sont généralement que de 95 °C, perdant facilement des informations importantes sur la dénaturation du repliement de la région FAB de l'imab (Figure 5 (A)).

Les données normalisées par supr - DSF sont comparées aux résultats DSC. Comme le montre la figure 5 (b), les trois pics sont appariés l'un à l'autre, démontrant la bonne cohérence des deux techniques, et l'utilisation de supr - DSF permet d'obtenir facilement des informations de haute qualité sur la stabilité des protéines.

Cas d'application typique - - criblage accéléré d'Excipients et de formules pour le Trastuzumab

La formulation de médicaments biothérapeutiques tels que les anticorps, etc. est fondamentale pour garantir l'efficacité, la faisabilité de la production et la sécurité, et détermine également les conditions de stockage et de transport. Les entreprises pharmaceutiques ont besoin de méthodes à haut débit pour examiner rapidement et de manière fiable un grand nombre de combinaisons de conditions afin de déterminer la meilleure formulation.

À l'aide de supr - DSF, les chercheurs ont examiné et analysé la stabilité de l'anticorps thérapeutique Trastuzumab dans 96 conditions différentes et ont terminé le test en 1,5 heure. Les résultats des tests sont très cohérents avec ceux de la calorimétrie différentielle à balayage (DSC). Si l'équipement d'automatisation de laboratoire est intégré, le dépistage de milliers d'échantillons peut être effectué chaque jour.

La courbe de fusion DSF montre deux zones de transition indépendantes et l'ajustement des données par la méthode des moindres carrés permet de déterminer les valeurs de tonset, les valeurs de TM et la variation enthalpique de Van der Waals (△h). La figure 3 (A, b) montre respectivement la courbe de fusion et le diagramme d'ajustement des excipients qui perturbent / renforcent la stabilité. La figure 4 (A) énumère tous les Excipients capables d'améliorer la stabilité des anticorps (par rapport à l'échantillon témoin).

Supr - DSF a correctement identifié les effets Stabilisants des excipients histidine et tréhalose utilisés dans le Trastuzumab commercialisé, et comme le montre la figure 4 (b), les données suprdsf ont une fiabilité et une cohérence exceptionnelles tout en fournissant des débits étonnamment élevés.

Obtention des paramètres de liaison par fluorescence différentielle à balayage à haut débit

La recherche analytique de liaison est un domaine clé de la recherche et du développement de médicaments, où la caractérisation des interactions et les valeurs de KD (constantes d'équilibre de dissociation, caractérisant l'affinité pour la liaison intermoléculaire) sont essentielles au choix des candidats, et les chercheurs ont besoin d'une variété d'approches complémentaires de principe pour cribler et identifier des milliers à des dizaines de milliers de composés de petites molécules dans la bibliothèque.

L'analyse des interactions moléculaires par supr - DSF, indépendamment de facteurs tels que les effets de surface, le transport de masse ou les problèmes d'indice de réfraction des tampons, fournit des mesures à haut débit et sans marquage sur une gamme de concentrations de liaison de l'Analyte.

La spécificité de la liaison peut être confirmée par la détection d'un changement de stabilité du complexe protéine - Ligand; Les valeurs de KD peuvent être calculées par la variation du spectre d'émission de fluorescence au moment de la dénaturation thermique et par la relation fonctionnelle de la concentration en Ligand. Les changements de stabilité induits par la liaison peuvent être détectés par supr - DSF même pour les molécules de liaison très faibles.

Avec une microplaque 384 standard, il est possible de filtrer la stabilité de milliers d'échantillons en une journée, confirmant ainsi l'état de liaison.

L'action de liaison du Ligand (tfmsa) à l'anhydrase carbonique humaine I a été étudiée à l'aide de supr - DSF, les courbes de fusion de l'anhydrase carbonique en fonction de la concentration en tfmsa étant représentées sur la figure 6.

La figure 7 montre la valeur de TM de l'anhydrase carbonique I humaine en fonction de la concentration en tfmsa, les valeurs de KD obtenues ajustées étant de 2,1 µm et 174,2 µm respectivement, en relation avec

Les valeurs de la littérature sont cohérentes, démontrant que supr - DSF peut être utilisé comme outil de présélection ou de confirmation pour les études de liaison au Ligand et qu'il est sensible.

Logiciel intuitif et concis

Le logiciel supr - DSF offre des fonctionnalités intuitives, concises, intelligentes et efficaces de conception expérimentale et d'analyse de données, à la fois pour les débutants et pour les utilisateurs expérimentés.

À propos de proteinstable

Pour la filiale d'Applied photophysics, qui vise à introduire une technologie axée sur le client sur le marché du criblage et de la caractérisation des protéines, en mettant l'accent sur les méthodes de caractérisation des protéines à haut débit et à faible volume d'échantillon qui améliorent la productivité sans compromettre la qualité des données.

À propos de appliedphotophysics

Applied photophysics, une société de photophysique appliquée basée au Royaume - Uni, fournit depuis des décennies des programmes spécialisés pour la recherche structurelle et fonctionnelle de médicaments biologiques, avec des produits tels que le spectromètre CD dichroïque circulaire, l'analyseur cinétique de réaction à écoulement stoppé, l'analyseur de stabilité des protéines supr DSF

Attendez. Les utilisateurs se trouvent dans les grandes universités et les instituts de recherche et les sociétés pharmaceutiques du monde entier.

Les spectromètres CD dichroïques circulaires de la série chirascan sont largement utilisés dans la caractérisation structurelle avancée de médicaments biologiques tels que les protéines, y compris la structure secondaire des protéines, l'analyse structurelle tertiaire, ainsi que la stabilité thermique de la structure secondaire, l'étude de la stabilité thermique de la Structure tertiaire.