Kit de détection de potentiel de membrane mitochondriale JC - 1

Présentation du produit

le JC-1Kits de détection de potentiel de membrane mitochondriale(Kit d'essai du potentiel de la membrane mitochondriale JC-1) est une sorte dele JC-1Une sonde fluorescente, un kit rapide et sensible pour détecter les changements de potentiel de la membrane mitochondriale cellulaire, tissulaire ou purifiée. En raison de la chute du potentiel de la membrane mitochondriale est un événement marquant dans les premiers stades de l'apoptose. Ce kit peut donc être utilisé pour la détection précoce de l'apoptose.

le JC-1Est un type largement utilisé pour détecter le potentiel de membrane mitochondriale△ψmSonde fluorescente idéale pour le BIT.le JC-1Les colorants s'accumulent dans les mitochondries d'une manière dépendante du potentiel et peuvent être utilisés pour détecter les cellules, les tissus ou les potentiels de membrane mitochondriale purifiée. Dans les mitochondries normales,le JC-1Agrégation dans la matrice mitochondriale pour former un polymère qui émet une forte Fluorescence Rouge (Ex = 585 nm, Em = 590 nm); Mitochondries malsaines en raison de la chute ou de la perte du potentiel membranaire,le JC-1Ne peut exister que dans le cytoplasme sous forme de monomères produisant une Fluorescence verte (Ex = 514 nm, Em = 529 nm).le JC-1Non seulement peut être utilisé pour la détection qualitative, car le changement de couleur peut refléter très directement le changement de potentiel de la membrane mitochondriale. Peut également être utilisé pour la détection quantitative, en raison du degré de dépolarisation des mitochondries peut passer par rouge/La proportion de l'intensité de la fluorescence verte est mesurée.

Composition du produit

sauvegarderEt le transportPour:-20℃ protection contre la lumière et conservation sèche, au moins1Année valide. Transport:Sac de glacetransport

mode d'emploi Kit de détection de potentiel de membrane mitochondriale JC - 1

1. JC-1Préparation de liquide de travail de teinture

Pour les plaques à six trous, ce kit est détectable100Un échantillon. Nécessaire par troule JC-1La quantité de liquide de travail de teinture est1 ml, d'autres ustensiles de culture le JC-1Quantité de liquide de travail de teinture et ainsi de suite; Pour la suspension cellulaire chaque 50à100Millions de cellules nécessaires 0,5 ml JC-1Liquide de travail de teinture. Prendre la quantité appropriée le JC-1（200 ×), selon chaque50μL JC-1（200 ×) adhérer 8 mlDilution proportionnelle d'eau Ultrapure le JC-1. commotion violente bien dissous et mélangé le JC-1. puis rejoindre 2mL JC-1Tampon de teinture (5 ×), après mélange est le JC-1Liquide de travail de teinture.

[Note]:Il faut d'abord mettre le JC-1（200 ×) ne peut être ajouté qu'après avoir bien dissous le mélange avec de l'eau ultra pure (fourni avec le kit) le JC-1Tampon de teinture (5 ×). Pas à formuler en premier le JC-1Tampon de teinture (1 ×) adhérer à nouveau le JC-1（200 ×), de cette façon le JC-1Il sera difficile de se dissoudre suffisamment et affectera sérieusement la détection ultérieure.

2. Réglage des contrôles positifs

CCCP(10 mM) recommandé par 1Le:1000 Proportion ajoutée au fluide de culture cellulaire, diluée à 10 μM, traitement des cellules 20 minutes. chargement ultérieur selon la méthode décrite ci - dessous le JC-1, effectuer la détection du potentiel de la membrane mitochondriale. Pour la plupart des cellules, généralement 10μM CCCPtraiter 20 minutesLe potentiel membranaire des mitochondries postérieuresWanquanPerdu,le JC-1L'observation après coloration doit être fluorescente en vert; Les cellules normales le JC-1La fluorescence rouge doit apparaître après la coloration. Pour des cellules spécifiques,CCCPConcentration et durée d'action possibles

Il y a des différences, il faut se référer à la documentation pertinente pour décider.

3. Pour les cellules en suspension

1）取10à60 Millions de cellules, suspendues à 0,5 mlDans le liquide de culture cellulaire, le liquide de culture cellulaire peut contenir du sérum et du rouge de phénol.

2) adhérer0,5 ml JC-1Liquide de travail de teinture, mélanger plusieurs fois à l'envers. Dans un incubateur de cellules 37℃ incubation20 minutes- Oui.

3) pendant l'incubation, selon chaque 1mL JC-1Tampon de teinture (5 ×) adhérer 4 mlProportion d'eau distillée, formulée en quantité appropriée le JC-1Tampon de teinture (1 ×), et placé dans un bain de glace.

4) et37℃ après la fin de l'incubation,600×g4℃ centrifugation3à4 minutesPrécipitation des cellules. Défaussez le nettoyage et veillez à ne pas aspirer les cellules autant que possible.

5) avec le JC-1Tampon de teinture (1 ×) lavage 2 Fois: rejoindre 1mL JC-1Tampon de teinture (1 ×), cellules suspendues,600×g4℃ centrifugation3à4 minutesPrécipitez les cellules, défaussez - les. Adhérer à nouveau 1mL JC-1Tampon de teinture (1 ×), cellules suspendues,600×g4℃ centrifugation3à4 minutesPrécipitez les cellules, défaussez - les.

6) avec la quantité appropriée le JC-1Tampon de teinture (1 ×), après resurfaçage, observé avec un microscope à fluorescence ou un Microscope confocal laser, peut également être spectroscopique par fluorescence Détection photométrique ou analyse cytométrique en flux.

4. Pour les cellules plaquées

[attention]: pour les cellules tapissées, si l'on souhaite une détection par spectrophotomètre Fluorescent ou cytomètre en flux, on peut d'abord collecter les cellules, puis les remettre en suspension et les détecter par référence à la méthode des cellules en suspension.

1), pour un puits de la plaque à six puits, aspirer le liquide de culture, disponible si nécessaire en fonction des expériences spécifiques PBSOu une autre solution appropriée lave les cellules une fois, ajouter 1 mlFluide de culture cellulaire. Le sérum et le rouge de phénol peuvent être contenus dans le liquide de culture cellulaire.

2) adhérer 1mL JC-1Liquide de travail de teinture, bien mélanger. Dans un incubateur de cellules 37℃ incubation20 minutes- Oui.

3) pendant l'incubation, selon chaque 1mL JC-1Tampon de teinture (5 ×) adhérer 4 mlProportion d'eau distillée, formulée en quantité appropriée le JC-1Tampon de teinture (1 ×), et placé dans un bain de glace.

4) et37℃ après la fin de l'incubation, l'aspiration est enlevée, avecle JC-1Tampon de teinture (1 ×) lavage 2 Une fois.

5) adhérer 2 mlLe liquide de culture cellulaire, qui peut contenir du sérum et du rouge de phénol.

6), vue en microscopie à fluorescence ou en microscopie confocale laser.

5. Pour les mitochondries purifiées

1) sera formulé le JC-1Liquide de teinture à utiliser le JC-1Tampon de teinture (1 ×) Dilution 5 Le multiple.

2) et0.9mL 5Doublement dilué le JC-1Ajouter au liquide de travail de teinture 0,1 mlLa quantité totale de protéines est 10à100 μgMitochondries purifiées.

3) Détection avec un spectrophotomètre Fluorescent ou un étalon enzymatique Fluorescent: balayage temporel directement avec un spectrophotomètre Fluorescent après mélange (temps balayage), la longueur d'onde d'excitation est485 nm, la longueur d'onde d'émission est 590 nm. Si vous utilisez un étalon enzymatique fluorescent, la longueur d'onde d'excitation ne peut pas être réglée sur 485 nmLorsque, il est possible de475à520 nmRéglage de la longueur d'onde d'excitation dans la gamme. En outre, il est également possible de se référer aux étapes ci - dessous 6 Le réglage de longueur d'onde dans la détection de fluorescence.

4) observation au microscope à fluorescence ou au Microscope confocal laser: la méthode suit les étapes ci - dessous 6- Oui.

6. Observations de fluorescence et analyse des résultats

détection le JC-1La lumière d'excitation peut être réglée sur le monomère 490 nm, la lumière émise est réglée sur 530 nm; détection le JC-1Lorsque le polymère, vous pouvez régler la luminescence d'excitation sur 525 nm, la lumière émise est réglée sur 590 nm- Oui.

[Note1].: il n'est pas nécessaire de régler la lumière d'excitation et d'émission à la longueur d'onde maximale d'excitation et à la longueur d'onde maximale d'émission pour déterminer la fluorescence ici. Si observé avec un microscope à fluorescence, détecter le JC-1Le polymère peut être utilisé normalement pour détecter l'iodure de Propidium ou Cy3Filtre passe - bande standard utilisé. détection le JC-1Les monomères peuvent être détectés normalement FITCou GFPFiltre passe - bande standard. L'apparition d'une Fluorescence verte indique que le potentiel de la membrane mitochondriale diminue et que la cellule est probablement au début de l'apoptose. L'apparition d'une Fluorescence Rouge indique que le potentiel de la membrane mitochondriale est relativement normal, tout comme l'état des cellules.

Précautions

1) etle JC-1（200 ×) dans4℃, bain de glace et d'autres conditions de température inférieure se solidifiera et collera au fond du tube centrifuge, à la paroi du tube ou à l'intérieur du couvercle du tube, peut20à25℃ bain d'eau incubé pendant un moment à utiliser après la fusion complète.

2) chargement terminé le JC-1Après utilisation le JC-1Tampon de teinture (1 ×) lors du lavage, faire le JC-1Tampon de teinture (1 ×) Maintenir 4℃ environ, l'effet de lavage est meilleur à ce moment - là.

3) etle JC-1La sonde est chargée et lavée autant que possible après 30 minutesLa détection ultérieure est terminée à l'intérieur. Conservation au bain de glace nécessaire avant détection.

4) ne mettez pasle JC-1Tampon de teinture (5 ×) Tout formulé enle JC-1Tampon de teinture (1 ×) et，Ce kit doit être utilisé directement pendant l'utilisationle JC-1Tampon de teinture (5 ×).

5) Si trouvé le JC-1Tampon de teinture (5 ×), il y a un précipité, il doit être tout dissous avant de pouvoir être utilisé, il peut être utilisé dans 37Le chauffage ℃ favorise la dissolution.

6) etCCCPPour les inhibiteurs de la chaîne de transmission électronique mitochondriale, toxiques, veuillez faire attention à la protection prudente.

7), pour votre sécurité et votre santé, Veuillez porter des vêtements expérimentaux et les utiliser avec des gants jetables.

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