Microscope confocal laser Leica

Le Microscope confocal laser Leica TCS sp8 DLS combine les avantages de deux systèmes d'imagerie en un seul: avec le Leica TCS sp8 DLS (Digital Light Sheet), vous pouvez obtenir une confocalisation avec un éclairage simple plan doux sur le microscope. En développant le réflecteur twinflect, nous avons pu transformer la plate - forme confocale Leica TCS sp8 en un microscope à lame optique multifonction simple à utiliser.

Le Microscope confocal laser Leica (par exemple, Leica sp8, série stellaris) est un système d'imagerie 3D haute résolution largement utilisé dans les domaines de la biomédecine, de la science des matériaux et d'autres domaines. Son fonctionnement nécessite une combinaison d'optique, de contrôle laser et de technologie de traitement d'image, voici le Guide d'utilisation détaillé:

I. préparation avant l'opération

1. Inspection de l'environnement et de l'équipement

Exigences environnementales:

Chambre noire indépendante ou environnement ombragé pour éviter que la lumière extérieure interfère avec le signal Fluorescent.

Contrôle de la température à 20 - 25 ℃, humidité ≤ 60%, empêche la condensation de la lentille ou la défaillance du circuit.

Inspection de l'équipement:

Vérifiez que le voyant d'état du laser (par exemple 405nm, 488nm, 561nm, 633nm) est OK (vert est prêt).

Vérifiez que l'objectif (par exemple, 10x / 0,3, 20x / 0,75, 63x / 0,4 miroirs à huile) est propre et que la table de chargement se déplace en douceur.

Allumez le système de refroidissement (par exemple, refroidisseur à eau laser) pour vous assurer que la température est stable à la valeur de consigne (généralement 18 - 22 ° c).

2. Préparation des échantillons

Échantillons biologiques:

Les cellules vivantes doivent être cultivées dans des boîtes de pétri spécialisées confocales telles que Lab - Tek II, en évitant les difficultés de mise au point causées par l'utilisation de lamelles de verre ordinaires.

Les coupes de tissus fixes doivent être scellées avec un agent de scellement anti - fluorescent, tel que prolong Gold, d'une épaisseur ≤ 20 μm.

Échantillon matériel:

Les échantillons non transparents doivent être polis à une rugosité de surface ra < 0,1 μm et les échantillons transparents (par exemple, les polymères) doivent éviter les interférences de fluorescence spontanée.

Exigences de marquage:

Les colorants fluorescents doivent être adaptés à la longueur d'onde du laser (par exemple, dapi excité à 405 nm et Alexa fluor 488 excité à 488 nm).

Lors du marquage multicolore, assurez - vous que le spectre d'émission du colorant ne se chevauche pas (les signaux peuvent être séparés par une fonction de division spectrale).

II. Processus opérationnel de base

1. Démarrage et initialisation

Ordre de démarrage:

Allumez la puissance totale → 2. Démarrez le système de refroidissement du laser → 3. Ouvrez le microscope principal → 4. Démarrez le logiciel de contrôle (comme Las X ou stellaris suite).

Auto - test du logiciel:

Le logiciel détecte automatiquement les modules tels que le laser, la tête de balayage, la table de chargement, etc., confirmant le statut "ready".

Exécutez la fonction "Daily check" pour calibrer le chemin optique et détecter la sensibilité du système (par exemple, gain PMT, puissance laser).

2. Positionnement et mise au point de l'échantillon

Aperçu du miroir à faible facteur:

Choisissez un miroir à air 10x, éteignez le laser et localisez rapidement la zone de l'échantillon à l'aide d'une lumière transmise, telle qu'une lampe halogène.

Déplacez - vous vers la position cible via le bouton XY de la table de chargement ou la fonction de navigation logicielle.

Mise au point confocale:

Allumez le laser 488nm (faible puissance, par exemple 5%), sélectionnez le mode "live" pour l'observation en temps réel.

Ajustez le moteur pas à pas de l'axe Z et utilisez l'outil "fine Focus" pour effectuer la mise au point étape par étape jusqu'à ce que le signal de fluorescence soit fort.

Lorsque vous passez à un objectif à haute densité (par exemple, un miroir à huile 63x), vous devez appliquer une immersion d'huile spécifique (par exemple, de l'huile de type F) entre l'objectif et la lame.

3. Paramètres d'acquisition d'image

Puissance laser vs gain PMT:

Puissance laser: augmenter progressivement à partir de 1% pour éviter le Photoblanchiment (généralement pas plus de 20%).

Gain PMT: ajustez la puissance du signal entre 100 et 800 (image 12 bits) pour éviter la saturation (> 4095).

Paramètres de scan:

Résolution: choisissez entre 512×512 (aperçu rapide) ou 2048×2048 (imagerie de haute précision) en fonction des besoins.

Vitesse de balayage: nombre moyen de lignes 1 - 4 (augmente lorsque le bruit est élevé), nombre moyen de trames 1 - 8 (diminue lorsque les cellules vivantes sont imagées dynamiquement).

Taille du trou d'épingle: généralement fixé à 1 unité Airy (au), équilibrant la résolution par rapport au rapport signal / bruit.

Paramètres spectraux:

Lors du marquage multicolore, Scannez le spectre d'émission de l'échantillon en mode "lambda Scan", réglez la plage de longueur d'onde (par exemple dapi: 410 - 480 nm, Alexa fluor 488: 500 - 550 nm).

4. Imagerie 3D et séries chronologiques

Empilement de l'axe Z:

Réglez la position de début / fin et le pas (par exemple 0,5 μm), le logiciel prend automatiquement des images multicouches et synthétise le modèle 3D.

Séries temporelles:

Lorsque vous imagez des cellules vivantes, enregistrez le processus dynamique en définissant un intervalle de temps (par exemple, 1 image toutes les 30 secondes) et un nombre total d'images (par exemple, 100 images).

L'activation de la fonction "autofocus" maintient la mise au point stable et évite la défocalisation causée par le déplacement des cellules.

Iii. Applications fonctionnelles de la microscopie confocale laser Leica

Mode d'éclairage (Light Sheet)

Convient pour l'imagerie rapide à faible phototoxicité d'échantillons épais tels que des embryons de poisson zèbre.

Étapes opérationnelles:

Basculez sur le module de feuille de lumière, Ajustez l'épaisseur de la Feuille de lumière d'éclairage (généralement 2 - 5 μm).

Configurez une acquisition synchrone à double caméra (par exemple, lumière transmise et signaux fluorescents).

Reconstruisez une structure tridimensionnelle en assemblant des images Multi - Angles grâce à la fonction « Multi - view ».

2. Imagerie de super - résolution (comme sted)

Repousse les limites de diffraction avec une résolution allant de 20 à 50 nm.

Points opérationnels:

Utilisez un objectif sted dédié, tel qu'un miroir à huile 100X / 1,4, et un laser depletion, tel que 592nm.

Ajustez la puissance du laser depletion (généralement 50 - 200mW) et le mode de masque de phase (par exemple, 2d ou 3D sted).

Le traitement de déconvolution est effectué après l'acquisition à l'aide du logiciel "Huygens" ou "Thunder".

3. Division spectrale et déconvolution linéaire

Séparation des signaux de chevauchement lors de marqueurs multicolores:

Acquisition d'une bibliothèque de spectres d'émission d'échantillons en mode "lambda Scan".

Les données spectrales sont chargées dans l'outil "spectral unmixing" et le logiciel calcule automatiquement le signal pur de chaque canal.

Ajuster le seuil supprime le bruit de fond et enregistre l'image après la Division.

Iv. Entretien et maintenance

1. Nettoyage quotidien

Éléments optiques:

Nettoyez l'objectif, la poussière de la surface du filtre avec un ballon soufflé et désactivez l'essuyage direct avec un coton - tige ou une serviette en papier.

Pour le nettoyage, tremper une petite quantité d'éthanol (ou un liquide de nettoyage spécial) avec du papier objectif et frotter doucement en spirale.

Table de chargement et bac à échantillons:

Essuyez avec un chiffon Antistatique pour éviter l'immersion résiduelle d'huile ou de scellant.

2. Entretien du laser

Restrictions d'utilisation:

Pas plus de 8 heures de travail continu pour éviter les dommages causés par la surchauffe du tube laser.

Réduisez la puissance du laser à 1% lors de l'arrêt, puis éteignez l'interrupteur du laser.

Surveillance de la durée de vie:

Voir la durée de vie restante (par exemple, 488nm laser habituellement ≥ 20000 heures) dans l'interface du logiciel "Laser status".

Vers la fin de vie, contactez Leica à l'avance pour remplacer le tube laser.

3. Calibration régulière

Calibration du chemin optique:

Calibrer l'Axe optique et l'alignement des trous d'épingle trimestriellement à l'aide de microsphères fluorescentes standard telles que tetraspeck.

Calibration mécanique:

La précision de l'axe XY / z de la table de chargement est vérifiée chaque année (l'erreur doit être < 0,1 μm) et les paramètres du moteur pas à pas sont ajustés si nécessaire.

V. Résolution de problèmes courants

Image sans signal

Vérifiez si le laser est allumé, si le gain PMT est > 0, si le filtre correspond (par exemple, si le filtre d'émission ne bloque pas le signal).

Image floue

Vérifiez que l'immersion de l'objectif dans l'huile est suffisante, que les trous d'épingle sont décalés et que l'échantillon est plat (p. ex., défocalisation causée par des excroissances de cellules vivantes).

Puissance laser instable

Nettoyez la fenêtre de sortie du laser et vérifiez si la température de l'eau du système de refroidissement est dans la plage définie (par exemple ± 0,5 ° c).

Logiciel Katun

Fermez d'autres programmes volumineux, réduisez la résolution de l'image ou la vitesse de numérisation, ou augmentez la mémoire de l'ordinateur (32 go ou plus recommandés).

Considérations de sécurité pour le Microscope confocal laser Leica

Sécurité laser:

Porter des lunettes de protection laser pendant le fonctionnement (la longueur d'onde doit couvrir toutes les lignes laser utilisées).

Il est interdit de regarder directement le faisceau laser ou de réfléchir la lumière et d'éviter l'exposition prolongée de la peau à des lasers de haute puissance (par exemple > 50 MW).

Biosécurité:

Lorsque vous manipulez des cellules vivantes ou des agents pathogènes, travaillez à l'intérieur d'une armoire de biosécurité pour éviter la contamination des échantillons.

Sécurité chimique:

Lorsque vous nettoyez avec un solvant organique, tel que l'éthanol, travaillez à l'intérieur d'un placard ventilé pour éviter l'inhalation de gaz volatils.