One Step Gibson cloning Kit clone sans couture

Kit de clonage Gibson à une étape

(1 - 5 segments peuvent être joints)

One Step Gibson cloning Kit clone sans couture

Numéro de catalogue:42112

Quantité emballée:

Stockage des produits:-20°CConserver, éviter le gel - dégel répété

Description de l'article: cet article ne dépend pas deT4Ligase, qui n'est pas limitée par le vecteur et le site de coupure enzymatique du fragment d'intérêt, tandis que la méthode de recombinaison directe avec des fragments superposés, en utilisant une combinaison enzymatique spéciale peut linéariser toute méthode après le vecteur et avoir ses deux extrémités15-25bpDe la zone de chevauchementla PCRRecombinaison dirigée du fragment (extrémité plate), qui peut être réalisée rapidement1 à 5Clonage efficace et sans couture d'un fragment.

Caractéristiques du produit:

1. 30Les minutes peuvent être une ou plusieurs longues et courtesla PCRLe fragment amplifié (extrémité plate) est inséré dans le vecteur.

2. Disponibilité des sites de coupure enzymatique des fragments non soumis au vecteur et insérés et extrémité plate du vecteur/Restriction de l'extrémité visqueuse, le clonage peut être réalisé en tout site.

3.Clone sans couture, le point d'insertion n'introduit pas de séquences de bases indésirables.

4.Efficace, précis, positif >95%- Oui.

Préparation de vecteurs linéarisés et de fragments d'ADN insérés:

A: préparation du support linéarisé

(1). Source de coupure enzymatique:Le vecteur linéaire résultant du clivage enzymatique, les extrémités plates ou visqueuses, le clivage enzymatique simple ou double peuvent être, le clivage enzymatique après récupération de la colle.

Remarque: l'épissure sans couture et le système réactionnel de clonage ne contiennent pas d'ADN ligase double brin, aucune réaction d'autoligation du vecteur ne se produit. Ainsi, même les supports linéarisés préparés de manière mono - enzymatique ne nécessitent pas de traitement de déphosphatation terminale. Les Clones faussement positifs (sans fragment d'insertion) apparaissant après transformation du produit Recombinant sont formés par transformation d'un vecteur cyclique totalement non linéarisé, sécable enzymatiquement. Nous recommandons que la récupération de colle après découpage enzymatique puisse réduire cette proportion de vecteurs non linéarisés à un faible zui.

(2). Source de PCR inverse:La préparation à l'aide d'une ADN polymérase haute fidélité (réf. Produit: p517 - 05) est recommandée si la bande amplifiée seule permet d'obtenir le vecteur par purification du produit PCR (réf. Produit: dc012 - 100), sinon par récupération de colle (réf. Produit: dc012 - 100).

Remarque: la matrice plasmidique de la PCR inverse est également un vecteur non linéarisé et peut également conduire à des clones faussement positifs (sans fragment d'insertion), de sorte que la digestion de la matrice plasmidique avec l'endonucléase DPN I avant la purification du vecteur linéaire d'origine PCR (produit de PCR) peut réduire le fond et améliorer le taux de positivité. Mais en général, le recyclage de la colle est déjà suffisant pour réduire cette proportion de supports non linéarisés à zui faible, de sorte que les supports linéarisés provenant de la PCR inverse sont également recommandés pour le recyclage de la colle.

B: préparation des fragments d'ADN insérés

(1). Conception d'amorces de clonage de fragments d'insertion individuels: les amorces de clonage comprennent des séquences d'amorces spécifiques de fragments d'insertion et des séquences de chevauchement.

Amorce avant clonée (5 '- 3'): séquence de la région de recouvrement 16 - 25 nt vers l'avant du vecteur linéaire (comptée à l'extrémité 3 ') + séquence d'amorce spécifique vers l'avant du fragment d'insertion (18 - 25 nt)

Amorce inverse clonée (5 '- 3'): vecteur linéaire séquence inverse de 16 - 25 nt de la région de recouvrement (comptée en 3 ') + séquence d'amorce spécifique inverse du fragment d'insertion (18 - 25 nt)

Attention:La base de la zone de chevauchement est d'au moins 16 pb et la valeur de TM entre les zones de chevauchement multisegments doit être constante et & gt; 60 °C (at pair = 2 °C et GC pair = 4 °C), sinon le nombre de bases peut être prolongé jusqu'à ce qu'il soit conforme.

Suivant la structure de l'extrémité du support linéaire (5 'saillant, 3' saillant, extrémité plate), la conception de l'amorce est également divisée en 3 cas.

Les deux extrémités du vecteur linéarisé sont différentes en raison de la manière linéaire (par exemple, Single enzyme Cut, double Enzyme Cut, Reverse PCR), peut être deux ou deux combinaisons arbitraires des trois structures d'extrémité ci - dessus, le principe de la conception d'amorces spécifiques du fragment d'insertion suit le principe de la conception d'amorces générales.

Lors du calcul de la température de recuit des amorces d'amplification, il suffit de calculer la valeur de TM de la séquence d'amplification spécifique du gène et la séquence homologue terminale du vecteur ne doit pas participer au calcul.

Selon le principe de conception ci - dessus, calculé à partir de l'extrémité 3 ', il suffit d'additionner 16 Pb - 25 Pb (cet example utilise une séquence identique superposée à l'extrémité de 20 Pb) avant la séquence d'amorce spécifique du fragment cible. Assurez - vous que les valeurs de TM dans la zone de chevauchement sont constantes et & gt; 60 °C (at pair = 2 °C et GC pair = 4 °C).

Les amorces avant sont spécifiques comme suit: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Remarque: les sites de coupure enzymatique ecor I disparaîtront une fois que le schéma d'amorce ci - dessus aura terminé la ligation clonale (aucun site de coupure enzymatique n'est conservé).

Si la conservation est nécessaire Un site de coupure enzymatique ecor I nécessitant le complément de la séquence aattc du site de reconnaissance ecor I délétée entre la séquence de recouvrement de 20 pb à l'extrémité du vecteur et la séquence d'amorce spécifique du fragment d'intérêt,Une fois la ligation clonale terminée, le site de coupure de l'enzyme ecor I reste présent (site de coupure enzymatique conservé).

Exactement comme suit: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCG aattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Le vecteur est coupé par l'enzyme Hind III pour former une extrémité saillante 5 ':

Selon le principe de conception ci - dessus, calculé à partir de l'extrémité 3 ', il suffit d'additionner 16 Pb - 25 Pb (cet example utilise une séquence identique superposée à l'extrémité de 20 Pb) avant la séquence d'amorce spécifique du fragment cible. Assurez - vous que les valeurs de TM dans la zone de chevauchement sont constantes et & gt; 60 °C (at pair = 2 °C et GC pair = 4 °C).

Les amorces inversées sont spécifiques comme suit: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Remarque: le site de coupure Hind III disparaîtra une fois que le schéma d'amorce ci - dessus aura terminé la liaison clonale (le site de coupure enzymatique n'est pas conservé).

Si la conservation est nécessaire Site de clivage enzymatique Hind III nécessitant un complément de la séquence agctt du site de reconnaissance Hind III délétée entre la séquence de recouvrement de 20 pb à l'extrémité du vecteur et la séquence d'amorce spécifique du fragment d'intérêt ，Le site de coupure enzymatique Hind III est toujours présent (le site de coupure enzymatique est conservé).

Exactement comme suit: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

(2). Conception d'amorces clonales pour plusieurs fragments insérés: méthode de conception d'amorces de fragments insérés connectés aux deux extrémités du vecteur

* La zone de chevauchement entre plusieurs fragments d'insertion est conçue de deux manières avec le * marquage ci - dessus (bleu et rouge), lors de la conception de l'amorce Multi - fragments, sélectionnez l'une ou l'autre ou les deux méthodes peuvent être mélangées, garantissant une zone de chevauchement de 15 à 25 pb entre Le fragment et le fragment.

(3). Choix de l'enzyme: il est recommandé d'utiliser l'ADN polymérase haute fidélité ou la PCR mix (référence: p517 - 05 ou p814 - 05).

(4). Conditions de réaction: généralement selon les instructions spécifiques à l'utilisation de la polymérase.

(5). Purification du fragment d'insertion

lFacultatif:Si le fragment provient d'une matrice plasmidique et que ce plasmide présente la même résistance que le vecteur Recombinant, la digestion de la matrice plasmidique par l'endonucléase DPN I avant purification permet de réduire le fond et d'améliorer la positivité.

lSi le fragment est monolithique, il est recommandé de le purifier avec un kit de purification de produit PCR (réf. Produit: 43012 - 100).

lS'il y a amplification non spécifique, il est recommandé de récupérer les fragments avec un kit de récupération de colle (réf. Produit: 43011 - 100).

lEn utilisant cette méthode pour cloner, le site de coupe enzymatique utilisé pour linéariser le vecteur sera manquant au moment de l'épissure, s'il existe des exigences strictes pour le site de coupe enzymatique, il est recommandé Faites attention au choix des sites de coupure enzymatique, si nécessaire, vous pouvezEntre la séquence de la région de chevauchement et la séquence du gène spécifique de l'amorce de clonage inverse positiveAugmenter les bases manquantes pour restaurer le site de coupure enzymatique original (voir l'exemple de conception d'amorce inverse positive ci - dessus).

lSi le plasmide Recombinant est utilisé pour l'expression de la protéine, le cadre de lecture, l'expression de la protéine et la séquence requise pour la purification (par exemple, promoteur, séquence RBS, codon d'initiation, codon de terminaison, étiquette de protéine, etc.) ne sont pas détruits lors de la conception de l'amorce.

Étapes opératoires pour une réaction de clonage sans soudure:

Remarque: 2 × cloning Master Mix contient un renfort de connexion PEG très visqueux, plus visqueux lorsqu'il est sorti du réfrigérateur lorsque la température est basse, peut être placé dans la congélation de la main pendant quelques minutes pour augmenter la température pour réduire la viscosité (sans affecter la qualité), doigtsBo Mélanger bien au fond du tube de centrifugation ou mélanger au vortex.

1. Suivez le tableau ci - dessous pour établir le système réactionnel (peut être formulé à température ambiante à l'aide d'un tube PCR)

* Le vecteur est généralement utilisé avec 10 - 50 ng, le rapport molaire du fragment inséré au vecteur est optimal entre 2: 1 - 3: 1; Si le fragment inséré est inférieur à 200 pb, le rapport molaire entre le fragment inséré et le vecteur est de 5: 1 dans le cas d'une liaison multifragment, le rapport molaire entre le fragment et le fragment est de 1: 1.

2. Mélanger doucement, à 50°C réaction pendant 15 minutes (peut être effectuée sur un instrument PCR), après la fin de la réaction, la PCR a été transformée directement sur la glace ou conservée à - 20°C. au - delà de 3 ligatures de fragments, le temps de réaction peut être prolongé jusqu'à 30 minutes.

3. Prenez 5 µl du produit de réaction pour le transformer selon les instructions pour les cellules réceptrices (s'il y a moins de transformants, tous les produits peuvent être transformés et tout le liquide de conversion peut être enduit de plaques).

Identification des clones positifs:

L'identification par PCR de la colonie peut être sélectionnée au cas par cas et le plasmide extrait (numéro de produit 31011 - 100) pour l'identification des endonucléases de restriction ou l'identification par séquençage.

One Step Gibson cloning Kit clone sans couture