Zero background flat end kit de clonage rapide T4 Principe

Kit de ligation rapide simple Zero-Blunt
pZERO-Blunt SimpleZero background flat end kit de connexion rapide
(Sans MCS)

Zero background flat end kit de clonage rapide T4 Principe

Numéro de catalogue: 42113

Composition du kit, stockage, stabilité:

- 20 ℃ stockage, 6 mois n'affecte pas l'efficacité de l'utilisation.

Introduction du produit:

Zero background flat end Fast Connection Kit est un excellent système de clonage sélectif positif Zi - genicide qui permet de cloner efficacement les produits PCR Flat - end et tout fragment d'ADN à extrémité plate. Ce kit est efficace sur les fragments d'ADN phosphorylés ou non. Le vecteur de sélection positif et la ligature du fragment d'insertion ne prennent que 5 minutes pour obtenir plus de 90% des clones Recombinants positifs. Les produits de PCR à extrémité plate amplifiés par une polymérase à activité correctrice telle que: Pfu Polymerase peuvent être directement ligaturés dans le vecteur de clonage. Les produits de ligation peuvent transformer directement les souches d'Escherichia coli couramment utilisées.

Le kit fournit un nouveau vecteur de clonage de sélection positif Zi - genicide, pzero - Blunt simple. Ce vecteur contient un Zi - génocide mortel, lorsque la liaison du vecteur au fragment est réussie, le Zi - génocide ne peut pas être exprimé correctement et les cellules contenant le Recombinant peuvent se développer normalement; Lorsque la ligation du vecteur avec le fragment est infructueuse, le génocide Zi est correctement exprimé après l'auto - ligation du vecteur et les cellules contenant le vecteur auto - ligaturé ne peuvent pas survivre, c'est - à - dire avec un fond "zero zero". Cette stratégie de dépistage positive ne nécessite pas de dépistage par taches bleues et blanches, ce qui accélère considérablement le processus de dépistage par clonage.

Pzero Blunt simple élimine les sites de clivage enzymatique polyclonaux près du site d'insertion et nécessite l'importation de sites de clivage enzymatique appropriés sur les amorces d'amplification PCR. À ce stade, si le clivage enzymatique de l'ADN est effectué en utilisant le site de clivage enzymatique importé par l'amorce d'amplification PCR, la réaction de clivage enzymatique ne sera pas affectée par l'enzyme de restriction sur d'autres sites de clivage enzymatique Polyclonal sur le vecteur T, ce qui peut grandement améliorer l'efficacité du clivage enzymatique et augmenter le succès de sous - clonage.

Étapes opérationnelles:

1. Préparation de la réaction de connexionPour:

Les produits de PCR à extrémité plate ou les fragments à extrémité plate après clivage enzymatique peuvent être récupérés par séparation par électrophorèse sur gel d'agarose (en utilisant une découpe par ultraviolet à ondes longues ou une découpe par transmission visible pour éviter les défauts de ligation dus à des dommages à l'ADN). Le rapport molaire avec le porteur est de 3: 1. Les kits de récupération de purification rapide de produits d'ADN fabriqués par la société permettent une bonne récupération des fragments d'ADN de plus de 70 pb.

2. Réaction de connexion rapide:

1) Dans un standard de 10mL connecter le système réactionnel, ajouter 1mL 40, < num > pzero émoussé simple ch n ° 1mL produits de PCR (dans les conditions habituelles, il n'est pas nécessaire de quantifier avec précision les produits de PCR, le rapport molaire général des produits de PCR au support est optimisé à 1: 1 ~ 10: 1 pour obtenir de bons résultats, 3: 1 est recommandé, voir annexe), 5ml 2»Quick ligation buffer et 0,9mL d'ADN T4 ligase, le reste est complété par de l'eau stérilisée.

La réaction s'effectue selon le système suivant:

L'ADN T4 ligase est généralement ajouté en dernier.

2) 22 ℃ connexion 5 - 10 minutes (généralement peut être fait dans l'instrument PCR).

La ligation à 22 ° c est généralement recommandée pendant 5 - 10 minutes, et la ligation de fragments longs > 3 KB peut être prolongée jusqu'à 30 minutes. Plus de 30 minutes ne sont pas recommandées, au - delà de ce qui peut réduire le nombre de transformants.

3) Refroidissement sur glace puis transformation ou stockage à - 20°C.

3. Transformation:

1) 100mL cellules de l'état sensible, placé sur la glace, Wan complètement décongelé après un léger coup plusieurs fois mettre les cellules en suspension uniformément.

2) Adhésion 4 - 5mL liquide de liaison (tout au plus peut être ajouté, à condition que le volume de liquide de liaison ne dépasse pas 1 / 10 du volume de la cellule réceptrice), mélanger doucement. Laissez reposer sur la glace pendant 30 minutes.

3) Bain d'eau à 42 ° C pendant 90 secondes. Laissez reposer sur la glace pendant 2 à 3 minutes.

4) Ajouter 500mL de milieu LB ou SOC (sans antibiotiques) incubé sous agitation à 37°c à 150 tr / min pendant 60 min.

5) Sera 200mL revêtement bactérien sur Penicillium ampicillium su (100mG / ML) sur plaque.

La quantité de bactéries enduites est ajustée de manière appropriée en fonction de l'efficacité de la connexion et du taux de sensibilité des cellules réceptrices, si moins de clones sont attendus, une partie du liquide de culture peut être aspirée après centrifugation (4000 RPM, 2 minutes), laissant une quantité appropriée de milieu de culture en suspension et tout ou une quantité appropriée de bactéries enduites dans une plaque (le liquide restant enduit peut être conservé à 4 degrés, le jour 2 Si le nombre de colonies transformées est faible, le liquide restant peut être enduit d'une nouvelle plaque).

6) Les plaques sont placées en avant à 37°c pendant 1 heure pour absorber l'excès de liquide, puis incubées à l'envers pendant une nuit.

4. Filtrer:

5. Test de routine: les colonies obtenues sont inoculées avec 1 à 5 ml de LB (contenant une concentration finale de 100)mG / ml de milieu de Penicillium ampicillium su), incubation sous agitation à 37°c pendant une nuit, extraction du plasmide après conservation des souches, application de méthodes de PCR ou de clivage enzymatique pour déterminer si le fragment inséré est correct.

6. Détection rapide: les colonies sélectionnées sont directement testées par PCR (voir Molecular Cloning version 3 ou se référer à la notice cv05 - General t Vector Colony PCR Identification kit de la société).

7. Identification par séquençage: utilisez le kit pour apporter vos propres amorces ou le séquençage des amorces du promoteur T7 pour déterminer si elles contiennent des clones cibles.

Ce kit apporte ses propres amorces de séquençage (également pour les amorces d'identification PCR des colonies):

Annexe:

Dans Comment calculer la quantité de produit PCR nécessaire dans la réaction de ligation?

Le rapport molaire du produit de PCR général au support optimisé à 1: 1 ~ 10: 1 (3: 1 recommandé) peut obtenir de bons résultats, la formule suivante peut être utilisée:

[quantité de vecteur ajouté (ng) × taille du fragment inséré (KB) ÷ taille du vecteur (KB)] × rapport molaire du fragment inséré et du vecteur = quantité du fragment inséré (ng) par exemple: le rapport molaire entre le fragment inséré et la jonction du vecteur est de 3: 1, comme dans La réaction de ligation, le vecteur est ajouté 40 Ng et la taille du fragment inséré est de 500 pb, la quantité de fragment inséré qui devrait être ajoutée est [40 ng de vecteur × 0,5 KB de fragment inséré ÷ 2974 KB de vecteur] × 3 / 1 = 20,2 ng.

Zero background flat end kit de clonage rapide T4 Principe