One Step Seamless cloning Kit clone sans couture

Kit de clonage sans couture en une étape (Un seul fragment)

One Step Seamless cloning Kit clone sans couture

Numéro de catalogue:42111

Quantité d'emballage:

Stockage des produits:-20°C conserver pour éviter plusieurs gelées et dégel répétés

Description du produit:Le kit de clonage sans couture par la méthode en une étape ne dépend pas de la ligase T4 et n'est pas limité par les sites de coupure enzymatique du vecteur et du fragment d'intérêt, tandis que la méthode de recombinaison directe avec des fragments superposés, en utilisant une combinaison enzymatique spéciale peut linéariser une méthode arbitraire après la ligature de recombinaison dirigée du vecteur et de son fragment PCR avec une région de recouvrement de 16 - 25 pb à ses deux extrémités, peut être réalisée en 30 minutes avec une extrémité a ou un fragment de produit PCR à extrémité plate pour un clonage sans couture directionnel efficace vers n'importe quel site

Caractéristiques du produit:

1. Un clone d'un fragment amplifié par PCR de 50 Pb - 15 KB (extrémité plate / a - terminale) peut être inséré n'importe où dans n'importe quel vecteur pendant 30 minutes.

2. Non limité par la disponibilité des vecteurs et des sites de coupure enzymatique des fragments insérés et des extrémités plates / visqueuses, le clonage peut être effectué à n'importe quel site.

3. Clone sans couture, le point d'insertion n'introduit pas de séquences de bases indésirables.

4. Ne dépend pas de la ligase et de la phosphatase, est efficace, précis et peut atteindre un taux de positivité clonale de plus de 95%.

Schéma de principe du kit de clonage sans couture en une étape:

Préparation de vecteurs linéarisés et de fragments d'ADN insérés:

A: préparation du support linéarisé

(1). Origine du clivage enzymatique: vecteur linéaire résultant du clivage enzymatique, extrémité plate ou visqueuse, clivage enzymatique simple ou double, récupération de la colle après clivage enzymatique.

Remarque: la méthode en une étape clone sans couture l'ADN ligase double brin dans le système réactionnel sans réaction d'auto - ligation du vecteur. Ainsi, même les supports linéarisés préparés de manière mono - enzymatique ne nécessitent pas de traitement de déphosphatation terminale. Les Clones faussement positifs (sans fragment d'insertion) apparaissant après transformation du produit Recombinant sont formés par transformation d'un vecteur cyclique totalement non linéarisé, enzymatiquement sécable. Nous recommandons que la récupération de colle après découpage enzymatique puisse réduire cette proportion de vecteurs non linéarisés à un faible zui.

(2). Source de PCR inverse: il est recommandé de préparer à l'aide d'une ADN polymérase haute fidélité si la bande amplifiée seule permet d'obtenir le vecteur par purification du produit de PCR (réf.: dc012 - 50), sinon par récupération de colle (réf.: dc012 - 50).

Remarque: la matrice plasmidique de la PCR inverse est également un vecteur non linéarisé et peut également conduire à des clones faussement positifs (sans fragment d'insertion), de sorte que la digestion de la matrice plasmidique avec l'endonucléase DPN I avant la purification du vecteur linéaire d'origine PCR (produit de PCR) peut réduire le fond et améliorer le taux de positivité. Mais en général, le recyclage de la colle est déjà suffisant pour réduire cette proportion de supports non linéarisés à zui faible, de sorte que les supports linéarisés provenant de la PCR inverse sont également recommandés pour le recyclage de la colle.

B: préparation des fragments d'ADN insérés

(1). Le principe général de la conception d'amorces de clonage sans soudure par la méthode en une étape est le suivant: en introduisant une séquence homologue à l'extrémité terminale du vecteur de clonage linéarisé à l'extrémité 5 'de l'amorce, les extrémités extrêmes des produits d'amplification des fragments d'insertion 5' et 3 'portent respectivement une séquence Wan entièrement cohérente (16 Pb - 20 Pb) aux deux extrémités du vecteur de clonage linéarisé.

(2). Conception d'amorces de fragments d'insertion: les amorces de clonage comprennent des séquences d'amorces spécifiques de fragments d'insertion et des séquences de chevauchement.

Amorce avant clonée (5 '- 3'): séquence de la région de recouvrement 16 - 25 nt vers l'avant du vecteur linéaire (comptée à l'extrémité 3 ') + séquence d'amorce spécifique vers l'avant du fragment d'insertion (18 - 25 nt)

Amorce inverse clonée (5 '- 3'): vecteur linéaire séquence inverse de 16 - 25 nt de la région de recouvrement (comptée en 3 ') + séquence d'amorce spécifique inverse du fragment d'insertion (18 - 25 nt)

Remarque: la base de la zone de chevauchement est d'au moins 16 pb et la valeur de TM entre les zones de chevauchement multisegments doit être constante et & gt; 60 °C (at pair = 2 °C et GC pair = 4 °C), sinon le nombre de bases peut être prolongé jusqu'à ce qu'il soit conforme.

Suivant la structure de l'extrémité du support linéaire (5 'saillant, 3' saillant, extrémité plate), la conception de l'amorce est également divisée en 3 cas, schématisés comme suit:

Les deux extrémités du vecteur linéarisé sont différentes en raison de la manière linéaire (par exemple, Single enzyme Cut, double Enzyme Cut, Reverse PCR), peut être deux ou deux combinaisons arbitraires des trois structures d'extrémité ci - dessus, le principe de la conception d'amorces spécifiques du fragment d'insertion suit le principe de la conception d'amorces générales.

Lors du calcul de la température de recuit des amorces d'amplification, il suffit de calculer la valeur de TM de la séquence d'amplification spécifique du gène et la séquence homologue terminale du vecteur ne doit pas participer au calcul.

(3). Choix de l'enzyme: il est recommandé d'utiliser l'ADN polymérase haute fidélité ou la PCR mix (référence: p517 - 05 ou p814 - 05).

(4). Conditions de réaction: généralement selon les instructions spécifiques à l'utilisation de la polymérase.

(5). Purification du fragment d'insertion

l Optionnel: si le fragment provient d'une matrice plasmidique et que ce plasmide présente la même résistance que le vecteur Recombinant, la digestion de la matrice plasmidique par l'endonucléase DPN I avant purification permet de réduire le fond et d'améliorer la positivité.

l Si le fragment est monolithique, il est recommandé de purifier le fragment avec le kit de purification du produit PCR (réf. Produit: dc012 - 100).

l S'il y a amplification non spécifique, il est recommandé de récupérer les fragments avec un kit de récupération de colle (réf.: dc011 - 100).

l En utilisant cette méthode de clonage, le site de coupe enzymatique utilisé pour linéariser le vecteur sera manquant au moment de l'épissure, s'il existe des exigences strictes pour le site de coupe enzymatique, il est recommandé de prêter attention au choix du site de coupe enzymatique, qui peut être utilisé si nécessaire dansEntre la séquence de la région de chevauchement et la séquence du gène spécifique de l'amorce de clonage inverse positiveAugmenter les bases manquantes pour restaurer le site de coupure enzymatique original (voir les exemples ci - dessous).

l Si le plasmide Recombinant est utilisé pour l'expression de la protéine, le cadre de lecture, l'expression de la protéine et la séquence requise pour la purification (par exemple, promoteur, séquence RBS, codon d'initiation, codon de terminaison, étiquette de protéine, etc.) ne sont pas détruits lors de la conception de l'amorce.

Exemple de conception d'amorces avant (coupure enzymatique ecor i):

Comme dans la figure ci - dessus, le vecteur est découpé par l'enzyme ecor I pour former une extrémité saillante 5 ':

Selon le principe de conception ci - dessus, calculé à partir de l'extrémité 3 ', il suffit d'additionner 16 Pb - 25 Pb (cet example utilise une séquence identique superposée à l'extrémité de 20 Pb) avant la séquence d'amorce spécifique du fragment cible. Assurez - vous que les valeurs de TM dans la zone de chevauchement sont constantes et & gt; 60 °C (at pair = 2 °C et GC pair = 4 °C).

Les amorces avant sont spécifiques comme suit: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Remarque: les sites de coupure enzymatique ecor I disparaîtront une fois que le schéma d'amorce ci - dessus aura terminé la ligation clonale (aucun site de coupure enzymatique n'est conservé).

S'il est nécessaire de conserver le site de coupure de l'enzyme ecor I, il est nécessaire de compléter la séquence de site de reconnaissance ecor I manquante aattc entre la séquence de recouvrement de 20 pb à l'extrémité du vecteur et la séquence d'amorce spécifique du fragment d'intérêt, le site de coupure de l'enzyme ecor I restant après l'achèvement de la ligation clonale (site de coupure de l'enzyme conservé).

Exactement comme suit: 5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Exemple de conception d'amorces inversées (ouverture enzymatique Hind III):

Comme dans la figure ci - dessus, le vecteur est coupé par l'enzyme Hind III pour former une extrémité saillante 5 ':

Selon le principe de conception ci - dessus, calculé à partir de l'extrémité 3 ', il suffit d'additionner 16 Pb - 25 Pb (cet example utilise une séquence identique superposée à l'extrémité de 20 Pb) avant la séquence d'amorce spécifique du fragment cible. Assurez - vous que les valeurs de TM dans la zone de chevauchement sont constantes et & gt; 60 °C (at pair = 2 °C et GC pair = 4 °C).

Les amorces inversées sont spécifiques comme suit: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Remarque: le site de coupure Hind III disparaîtra une fois que le schéma d'amorce ci - dessus aura terminé la liaison clonale (le site de coupure enzymatique n'est pas conservé).

Si l'on souhaite conserver le site de coupure enzymatique Hind III, il est nécessaire de compléter la séquence agctt du site de reconnaissance Hind III délétée entre la séquence de recouvrement de 20 pb à l'extrémité du vecteur et la séquence d'amorce spécifique du fragment d'intérêt, le site de coupure enzymatique Hind III restant (site de coupure enzymatique conservé).

Exactement comme suit: 5 'CTGCCATCGGATCGTTCGCAagctt NNNNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Étapes opératoires pour une réaction de clonage sans soudure:

Remarque: 2 × ONESTEP cloning mix contient le renfort de connexion PEG est très visqueux, plus visqueux lorsque la température du réfrigérateur est basse, peut être placé dans la congélation centrifuge pendant quelques minutes pour augmenter la température peut réduire la viscosité (sans affecter la qualité), mélanger légèrement, centrifuger instantanément recueillir au fond du tube.

1. Suivez le tableau ci - dessous pour établir le système réactionnel (peut être formulé à température ambiante à l'aide d'un tube PCR)

* Le vecteur est généralement utilisé avec 20 - 50 ng, le rapport molaire du fragment inséré au vecteur est optimal entre 2: 1 - 3: 1; Si le fragment inséré est inférieur à 200 pb, le rapport molaire du fragment inséré au vecteur est de 5: 1.

2. Mélanger doucement, à 50°C réaction pendant 15 minutes (peut être effectuée sur un instrument PCR), après la fin de la réaction, la PCR a été transformée directement sur la glace ou conservée à - 20°Un fragment plus court, par exemple 100 Pb - 1 KB, ne prend que 15 minutes pour obtenir suffisamment de convertisseurs, et la ligature d'un fragment plus long peut prolonger le temps de réaction jusqu'à 60 minutes.

3. Prenez 5 µl du produit de réaction pour le transformer selon les instructions pour les cellules réceptrices (s'il y a moins de transformants, tous les produits peuvent être transformés et tout le liquide de conversion peut être enduit de plaques).

Identification des clones positifs:

L'identification par PCR de la colonie peut être sélectionnée au cas par cas et le plasmide extrait (numéro de produit 31013 - 100) pour l'identification des endonucléases de restriction ou l'identification par séquençage.

One Step Seamless cloning Kit clone sans couture