PC - 12 cellules de phéochromocytome surrénal de rat différenciées

PC - 12 cellules de phéochromocytome surrénal de rat différenciées

PC - 12 cellules de phéochromocytome surrénal de rat différenciéesEst une lignée de cellules de croissance épitaxiée dérivée du phéochromocytome médullaire surrénalien de rat, en raison de ses propriétés de différenciation inductible uniques sous l'action de facteurs spécifiques qui peuvent être différenciés en cellules neuroïdes, tout en conservant la fonction de sécrétion de neurotransmetteurs, est devenue un modèle in vitro classique pour l'étude du développement neurologique, de La signalisation nerveuse et de la réparation des lésions neurologiques, fournissant un vecteur expérimental clé pour la recherche fondamentale en neurosciences et la traduction clinique des maladies neurodégénératives.

I. caractéristiques biologiques fondamentales

(i) Association de la source avec le type de cellule

Cette souche cellulaire a été isolée à partir de tissus de phéochromocytome médullaire surrénalien de rat, qui ont naturellement la capacité de synthétiser et de sécréter des neurotransmetteurs catécholaminoïdes (par exemple, norshen - surrénatine, dopamine) qui fonctionnent très bien comme les cellules neuroendocrines du système nerveux sympathique. Les cellules PC - 12 ont une morphologie épithéliale à l'état indifférencié, combinant la capacité proliférative illimitée des cellules tumorales avec les propriétés basales des cellules neuroendocrines; Et dans les conditions d'induction peuvent se différencier vers les cellules neuroïdes, formant des protubérances nerveuses qui ont une partie de la structure et de la fonction des neurones, devenant un modèle unique pour la recherche reliant les cellules tumorales aux cellules nerveuses.

Ii) caractéristiques morphologiques et différenciées

À l'état indifférencié, les cellules sont polygonales ou elliptiques, avec une distribution d'agrégation dense lors de la croissance des parois, des connexions intercellulaires serrées, un cytoplasme contenant une petite quantité de particules alcalinophiles (particules de stockage de neurotransmetteurs), un noyau rond, un nucléole prononcé, une distribution uniforme de la chromatine, une forte capacité de prolifération et un temps de multiplication d'environ 48 à 72 heures.

Après l'induction de la différenciation, la morphologie cellulaire est modifiée de manière significative: sous l'action de facteurs tels que le facteur de croissance nerveuse (NGF), des protubérances nerveuses allongées (jusqu'à 5 à 10 fois le diamètre de la cellule) commencent à sortir dans les 24 à 48 heures, certaines des protubérances formant des branches et se reliant les unes aux autres, présentant une morphologie neuroïde typique; Augmentation des particules basophiles intracytoplasmiques, expression régulée à la hausse des enzymes associées à la synthèse des neurotransmetteurs (par exemple tyroanoate Hydroxylase) Tout en exprimant des marqueurs spécifiques des neurones (par exemple neurofilament protéine NF - 200, microtubular Associated Protein map2), tout en conservant une partie des caractéristiques des cellules de phéochromocytome (par exemple sécrétion de catécholamines), formant un phénotype unique de « cellules neuroïdes».

Iii) Caractéristiques moléculaires et fonctionnelles

Au niveau moléculaire, les cellules PC - 12 possèdent des caractéristiques moléculaires de base neuropertinentes: à l'état indifférencié, c'est - à - dire exprimant le récepteur du facteur de croissance Neural (TrkA, p75ntr), qui fournit une base moléculaire pour l'induction de la différenciation; Après différenciation, l'expression des gènes clés de la voie de synthèse des neurotransmetteurs (tyrosine - acide hydroxylase th, Dopamine - bêta - hydroxylase DBH) est significativement régulée à la hausse et la sécrétion de norshen - surrénatine, dopamine est augmentée de 3 à 5 fois par rapport à l'état indifférencié, détectable par chromatographie liquide à haute Performance (HPLC); Dans le même temps, l'expression des protéines associées à la signalisation nerveuse (par exemple, la protéine vésiculaire synaptique sv2, la synapsine i) est régulée à la hausse et possède certaines capacités de formation de structures synaptiques qui peuvent imiter la fonction de signalisation des neurones.

Fonctionnellement, les cellules PC - 12 différenciées sont sensibles aux substances neurotoxiques telles que la 6 - hydroxydopamine, l'amyloïde bêta, et des manifestations de lésions telles que la contraction de la protubérance nerveuse Wei, l'apoptose et d'autres apparaissent après l'exposition, qui s'harmonisent étroitement avec le processus pathologique des lésions neuronales et peuvent être utilisées Dans des études mécanistes sur les lésions nerveuses.

II. Culture in vitro et conditions de différenciation

(i) conditions de culture de base

Milieu de culture de base préféréUtiliserMilieu de culture rpmi - 1640Ajouter 10% de sérum de cheval, 5% de sérum de veau foetal (la combinaison de double sérum maintient la capacité de prolifération cellulaire et l'état indifférencié) et 1% de réactif antibactérien (pour prévenir la contamination bactérienne). L'environnement de culture doit être strictement maintenu à 37 ° C, 5% de co₂, 95% d'humidité, la fluctuation de la concentration de co₂ ne dépasse pas ± 0,5%, le pH est contrôlé à 7,2 - 7,4, osmolalité 280 - 320 mosm / kg; Une température trop élevée (> 39 °C) peut entraîner une augmentation du taux d'apoptose, ce qui nécessite une surveillance en temps réel des paramètres environnementaux par des capteurs d'incubateur.

(II) opération de différenciation induite

Les facteurs d'induction couramment utilisés sontFacteur de croissance nerveuse (NGF), les étapes spécifiques sont les suivantes:

En outre, d'autres facteurs inducteurs (par exemple, le facteur neurotrophique dérivé du cerveau bdnf, forskoline) peuvent également être utilisés, mais la répétabilité optimale de la différenciation induite par le NGF est un Protocole de différenciation couramment utilisé.

Iii) congélation et récupération

Le milieu rpmi - 1640 contenant 10% de diméthylsulfoxyde (DMSO), 20% de sérum de veau foetal et 10% de sérum de cheval a été utilisé comme lyophilisat pour ajuster la concentration en cellules indifférenciées à 1 × 10 ⁶ - 2 × 10 ⁶ cellules / ML (cellules différenciées sujettes à des lésions dues à des nerfs en saillie, la lyophilisation n'est pas recommandée) et après le fractionnement, la méthode de refroidissement par Gradient a été appliquée: 4 ° C pendant 30 minutes - 20 ° C pendant 1 heure - 80 ° C pendant la nuit est transféré à l'azote liquide pour une conservation à long terme.

Lors de la réanimation, le tube de lyophilisation est rapidement placé dans un bain - Marie à 37 ° C pendant 1 à 2 minutes pour décongeler, immédiatement ajouter 10 fois le volume de milieu de base préchauffé pour diluer, centrifuger 1000 × g pendant 5 minutes pour éliminer le DMSO, ensemencer dans des flacons de culture après remise en Suspension, la survie à la réanimation peut généralement atteindre plus de 75%. Après la réanimation doit être cultivé pendant 2 - 3 générations, à ce que la morphologie cellulaire est stabilisée avant l'induction de la différenciation, éviter le stress de réanimation affecte l'efficacité de la différenciation.

Iii. Principaux scénarios d'application expérimentale

I) Étude des mécanismes neurodéveloppementaux et de différenciation

Les cellules PC - 12 sont un modèle central pour l'étude de la neurodifférenciation: les mécanismes moléculaires par lesquels les facteurs neurotrophiques régulent la différenciation cellulaire peuvent être analysés en détectant l'activation des voies de signalisation TrkA (par exemple, les voies PI3K / Akt, RAS / MAPK) pendant l'induction du NGF; Utiliser des techniques d'interférence génique (par exemple, le gène TrkA Knockout sirna) pour observer la formation de protubérances nerveuses cellulaires et les changements dans l'expression des marqueurs neuronaux, afin de vérifier l'effet régulateur des gènes clés sur la différenciation; De plus, les effets des modifications épigénétiques (p. ex., méthylation de l'ADN, acétylation des histones) sur l'expression de gènes liés à la neurodifférenciation (p. ex., th, map2) peuvent être étudiés, en explorant les réseaux de régulation apparente du développement neurologique.

(II) Construction de modèles et étude des mécanismes des maladies neurodégénératives

En s'appuyant sur la sensibilité des cellules aux substances neurotoxiques après différenciation, plusieurs modèles in vitro de maladies neurodégénératives peuvent être construits:

Grâce à ces modèles, les médicaments neuroprotecteurs potentiels, tels que les antioxydants, les médicaments anti - inflammatoires, peuvent être examinés pour évaluer leur effet réparateur sur les dommages cellulaires.

(III) Réparation des lésions nerveuses et dépistage neurotrophique

Dans les études de réparation des lésions nerveuses, l'activité des médicaments neurotrophiques peut être évaluée à l'aide d'un modèle de différenciation cellulaire PC - 12: Coculture de médicaments candidats (par exemple bdnf, neurojie - GLYCOSIDES) avec des cellules différenciées, observation microscopique de la longueur des neurites par rapport au nombre de branches, détection du niveau d'expression de marqueurs neuronaux (par exemple map2), évaluation de l'effet stimulant du médicament sur la croissance des neurites. Dans les modèles de lésions nerveuses in vitro (p. ex., hypoxie, lésions induites par le stress oxydatif), après l'administration du médicament, la survie cellulaire, la libération de lactate déshydrogénase (LDH) (reflétant l'étendue des lésions cellulaires) sont détectées, l'effet neuroprotecteur du médicament est validé et le traitement clinique des lésions nerveuses est basé sur la recherche et le développement de médicaments.

Iv. Considérations relatives aux applications expérimentales