Services de préparation d'anticorps polyclonaux

Services de préparation d'anticorps polyclonaux

Multi - anti processus général de préparation: * préparation de l'antigène - + immunisation du lapin - → détection du titre et libération finale - + purification de l'affinité des anticorps - + concentration et conservation des anticorps.

Les étapes expérimentales spécifiques sont les suivantes:

1. Préparation du lapin

Sélectionnez deux lapins blancs de Nouvelle - Zélande sains de 6 semaines (environ 2 kg) et acclimatez - les à leur nouvel environnement de vie, Stabilisez - les pendant au moins quelques jours avant de procéder * prélèvement sanguin, pré - prélèvement sanguin (utilisé comme référence négative)

1.1 placez soigneusement le lapin dans une étagère fixe pour calmer le lapin;

1.2 raser soigneusement les poils des oreilles du lapin pour rendre les vaisseaux sanguins clairement visibles (également non rasés);

1.3 si nécessaire, les vaisseaux sanguins peuvent être gonflés en utilisant de petites boules de coton imbibées d'alcool pour appliquer le site vasculaire;

1.4 prélever environ 10 ml de sang (environ 5 ml de sérum) dans une veine de l'oreille à l'aide d'une seringue;

1.5 retirez soigneusement l'aiguille, appuyez correctement sur la plaie pour éviter le saignement, puis désinfectez la plaie avec une boule de coton alcoolisée;

1.6 placer le sang recueilli à 37 c inactivé pendant 30 min, puis à 4 'C pendant une nuit pour qu'il coagule et libère du sérum;

1.7 centrifuger le sang coagulé à 10 000 tr / min pendant 10 min; H. recueillir le surnageant, c'est - à - dire le sérum.

Immunité du lapin

2.1 L'antigène injecté pour deux lapins est de 1 ml, la solution tampon antigénique doit être exempte d'agents chimiques nocifs pour les lapins chaque lapin immunisation initiale de 400 µg d'antigène convient mieux, peut également être réduite de manière appropriée pour obtenir de meilleurs résultats, l'immunisation ultérieure est de 100 µg à chaque fois.

2.2 Bien mélanger 1m d'adjuvant de Freund * avec l'antigène 1m préparé, de couleur crème; .

2.3 retirer soigneusement le lapin de la cage, le lapin tissé est immunisé à 4 sites (à la fois le dos et la racine de la cuisse), 250 µl par site, l'aiguille est insérée sous la peau à un angle de 45 degrés de 1 à 2 cm, rester quelques secondes après l'injection pour empêcher l'écoulement de l'antigène.

2.4 Le cycle de la peste du lapin est de 20 jours et le sang est prélevé 7 à 10 jours après la fin de l'immunisation (y compris le prélèvement de sang à mi - parcours et la saignée finale), pour un total de 4 à 5 immunisations.

3. Détection de validité

3.1 2 références négatives de référence sont des sérums sanguins préprélevés, tous dilués à une concentration anti - initiale de 1 (diluant fermé); Référence positive comme précédent

Sérum positif

3.2 ajouter goutte à goutte 100 µl, 1 µg / M d'antigène par puits dans une plaque de 96 puits pendant une nuit à 49°c et incuber à 37°c pendant 2 heures.

3.3 verser la solution d'antigène, ajouter 200 µ de liquide de blocage par puits, 49c pendant une nuit ou 379c incuber pendant 2 heures.

3.4 verser le liquide de fermeture, tamponner sur le papier absorbant pour aspirer le liquide résiduel autant que possible, laver la plaque trois fois avec le liquide de lavage pour sécher le liquide résiduel autant que possible à chaque fois, pour le laisser pendant un certain temps, sécher à 37 ° C et bien fermer avec une poche scellée à 20 ° C pour le stockage.

3.5 prendre le paquet avec une bonne plaque de 96 puits,第---Les puits sont additionnés de 100 µl de liquide de référence négatif, le deuxième puits est additionné de 100 µl de liquide de référence positif et le troisième puits est additionné de 1: 500 d'antisérum à tester, les puits suivants étant dilués selon un rapport multiplicatif sur cette base, incubés à 37°c pendant 1 heure.

3.6 verser le liquide, laver la plaque trois fois avec le liquide de lavage et sécher. 100 µ de LGG anti - lapin de souris marqué HRP (dilution 1: 2000) sont ajoutés par puits et incubés à 37°c pendant 45 minutes.

3.7 verser le liquide, laver la plaque trois fois avec le liquide de lavage et sécher. 100 µ de substrat TMB (Sigma Single - part TMB) sont ajoutés par puits et incubés à 37°c pendant 5 à 20 minutes (le temps de rendu des couleurs est déterminé en fonction de la nuance de couleur).

3.8 on ajoute 50 µ de liquide de terminaison (H2SO4 2n) par puits et la valeur de l'absorption lumineuse à la longueur d'onde 450 nm est lue sur un étalon enzymatique.

La saignée finale peut être effectuée sur les lapins après que le test de puissance d'anticorps ait atteint plus d'un million.

Purification des anticorps

4 affinité des anticorps - préparation des colonnes d'affinité

4.1 peser un gel d'agarose de 1 mg de cnbr - sepherose 4B dans 2 mmol / l d'acide chlorhydrique, 4 'C pendant une nuit pour le rendre suffisamment soluble pour obtenir un gel soluble de 3 M.

4.2 transférer le gel dans une colonne de purification et laver le milieu 3 fois avec environ 20 ml d'acide chlorhydrique à 2 mmol / L.

4.3 laver le milieu avec le tampon de couplage - - une fois, parce que les groupes d'activation sont facilement hydrolysés au pH du tampon de couplage, cette étapeTerminé en quelques minutes.

4.4 ajouter au gel 5 à 10 mg d'antigène dissous dans 5 ml de tampon de couplage

4.5 mélanger doucement à température ambiante pendant 2 - 4 heures, ou 4 'C pendant la nuit, si nécessaire pour déterminer l'efficacité de liaison après cette étape, prendre une petite quantité de solution à mesurer. Le milieu est lavé une fois avec 20 ml de tampon de couplage.

4.6 ajouter 15 M1 d'une solution de BSA à 1% et incuber à température ambiante pendant 2 heures ou 4 'C pendant une nuit.

4.7 laver le milieu avec du tampon phosphate plus de 3 fois, chaque fois plus de 15 m H.

4.8 la solidification de l'antigène est terminée et peut être utilisée pour la purification.

4.9 s'il n'est pas utilisé immédiatement ou après l'utilisation, conserver avec de l'éthanol à 20%.

5. Purification et conservation de l'antisérum

5.1 antisérum dilué avec un volume égal de PBS, centrifugé à 5000 - 10000 / min pendant 15 minutes, enlever le nettoyage.

5.2 laver la colonne d'affinité antigénique avec 10 fois le volume de PBS pour équilibrer la colonne.

5.3 ajouter l'antisérum dilué à 10 m dans une colonne bien équilibrée.

5.4 mélanger doucement et agiter à température ambiante pendant 2 - 4 heures, ou 4 'C pendant la nuit

5.5 laver la colonne antigénique avec 10 fois le volume de PBS pour éliminer les hétéro - protéines liées à la colonne

5.6 laver la colonne avec 2 fois le volume d'éluant d'anticorps pour obtenir des anticorps spécifiques

5.7 Équilibrer la colonne avec 10 fois le volume PBS

5.8 colonne scellée avec 20% d'alcool, conservée à 4 'c.

Après obtention des anticorps élués, déminéralisés par dialyse dans du PBS après concentration sur saccharose ou polyéthylène glycol, la do des anticorps est déterminée à la longueur d'onde 280 nm à l'aide d'un Spectrophotomètre UV - visible, la do résultante divisée par 1,35 étant la concentration des anticorps testés, l'addition de 40 à 50% de glycérol à 20 ^ C permet une conservation à long terme.

Service en partie expérimental