Principe du kit de clonage rapide tblue - t simple Vector T4

pBLUE-T SimpleKit de clonage rapide de vecteur

Principe du kit de clonage rapide tblue - t simple Vector T4

Numéro de catalogue:42119

Composition du kit, stockage, stabilité:

- 20 ℃ stockage, 6 mois n'affecte pas l'efficacité de l'utilisation.

Introduction du produit:

Pblue - t simple Vector est un vecteur spécialisé pour le clonage de produits de PCR à haute efficacité (ta Cloning). Ce vecteur a été modifié à partir d'un plasmide pbluescript II SK (+) et, contrairement à la méthode traditionnelle t - vecteur ecor V post - Coupure plus t, psure - t simple a une efficacité de recombinaison plus élevée en modifiant pbluescript II SK (+) pour produire directement des bases t non appariées à l'extrémité 3 'de chaque côté de son site de polyclone original après l'introduction d'une coupure enzymatique xcm I au site de polyclone pbluescript II SK (+). Dans le même temps, il élimine les sites de coupure enzymatique polyclonale sur le vecteur pbluescript II SK (+), nécessitant l'importation de sites de coupure enzymatique appropriés sur les amorces d'amplification PCR. À ce stade, si le clivage enzymatique de l'ADN est effectué en utilisant le site de clivage enzymatique importé par l'amorce d'amplification PCR, la réaction de clivage enzymatique ne sera pas affectée par l'enzyme de restriction sur d'autres sites de clivage enzymatique Polyclonal sur le vecteur T, ce qui peut grandement améliorer l'efficacité du clivage enzymatique et augmenter le succès de sous - clonage. En outre, le système de connexion de vecteur de la société a des caractéristiques telles que le faible fond (moins de 10% de points bleus), le taux de recombinaison élevé (plus de 90% des points blancs ont des fragments insérés), peut être rapidement connecté. Les informations techniques relatives au vecteur pblue - t simple dont la séquence complète peut être référencée par référence à la séquence pbluescript II SK (+) sont listées à la fin de la description, sauf que sa séquence au site de coupure de l'enzyme polyclonale est légèrement différente.

Séquençage recommandé avec M13 Universal Sequencing amorce et T3 promotor amorce (voir carte plus loin)
Étapes opérationnelles:
1. Préparation de la réaction de connexion

Que le produit PCR soit purifié ou non dépend de la qualité du produit amplifié. Si le produit PCR est très propre, la réaction de ligation peut être effectuée directement sans purification. Mais s'il s'agit d'un produit PCR dont le plasmide modèle est susceptible de former également des taches blanches, la purification doit être effectuée. Les produits de PCR peuvent être séparés par électrophorèse sur gel d'agarose. Les kits de récupération de purification rapide de produits d'ADN fabriqués par la société permettent une bonne récupération des fragments d'ADN de plus de 70 pb.

Produits PCR amplifiés par la Taq, Tth, amplitaq, klentaq DNA polymérase, tous portant une protubérance 3 'à leurs extrémités-A. avec 3 '-Le produit de PCR en extrémité a - terminale peut être directement lié par clonage avec le vecteur pblue - t simple. Avec 3 '®Le produit PCR amplifié par l'ADN polymérase (enzyme haute fidélité) de l'activité de l'Exonucléase 5 'est à extrémité plate, et pour cloner ce produit PCR à extrémité plate, il faut d'abord procéder à 3' '-End plus a fonctionne.

2. Réaction de connexion conventionnelle:

1) Dans un standard de 10mL connecter le système réactionnel, ajouter 1mL 30% pblue - t simplemL produits PCR (dans les conditions habituelles, il n'est pas nécessaire de quantifier avec précision les produits PCR, le rapport molaire général des produits PCR au support est optimisé à 2: 1 ~ 10: 1 pour obtenir de bons résultats, 3: 1 recommandé), 1ml 10»Buffer de libération et 0.5-1mL (2,5 - 5 Weiss Units) de T4 ADN ligase, le reste est complété avec de l'eau. La réaction s'effectue selon le système suivant:

L'ADN T4 ligase est généralement ajouté en dernier.

2) 16 ℃ connexion pendant la nuit (généralement peut être fait dans l'instrument PCR).

Habituellement recommandé 16 ℃ connexion pour la nuit (10mLa quantité de ligase standard du système est de 2,5 unités Weiss), ce qui permet d'obtenir le plus grand nombre de transformants. Mais ce système contient PEG Enhancer peut améliorer l'efficacité de la connexion plusieurs fois, en cas de quantités élevées de ligase (10)mL système recommande une quantité de ligase de 5 unités de Weiss) 16 ℃ ligature pendant 30 minutes, ce qui peut répondre aux exigences de l'étude générale.

3) Refroidissement sur glace puis transformation ou stockage à - 20°C.

3. Réaction de connexion rapide:

1) La réaction s'effectue selon le système suivant:

L'ADN T4 ligase est généralement ajouté en dernier.

2) 22 ℃ connexion 5 - 10 minutes (généralement peut être fait dans l'instrument PCR).

2 »Quick ligation buffer contient déjà tous les composants de connexion rapide optimisés et recommande généralement une connexion à 22 ° C pendant 10 minutes (10)mL la quantité de ligase du système est de 5 unités de Weiss, la ligature des fragments longs peut être prolongée jusqu'à 30 minutes) peut généralement donner des résultats satisfaisants. En outre, ce système peut également être connecté à 16 ℃ pendant 30 minutes (10mL quantité de ligase du système est de 5 unités de Weiss), c'est - à - dire que les exigences de la recherche générale peuvent être satisfaites.

3) Refroidissement sur glace puis transformation ou stockage à - 20°C.

4. Transformation:

Dans 50 à 100mL cellules de l'état sensible, placé sur la glace, Wan complètement décongelé après un léger coup plusieurs fois mettre les cellules en suspension uniformément.

Dans Adhésion 4 - 5mL liquide de ligature (tout au plus peut être ajouté, à condition que le volume ne dépasse pas 1 / 10 du volume des cellules réceptrices), mélanger doucement. Laissez reposer sur la glace pendant 30 minutes. Bain d'eau à 42 ° C pendant 90 secondes. Laissez reposer sur la glace pendant 2 à 3 minutes.

Dans Ajouter 500mL de milieu LB ou SOC (sans antibiotiques) incubé sous agitation à 37°c à 150 tr / min pendant 60 min.

Dans Sera 200mL bactéries enduites au préalable 16m50 mg / ML IPTG et 40mL 20 mg / ML X - gal enduit sur une plaque de Penicillium ampicillium su.

La quantité de bactéries enduites est ajustée de manière appropriée en fonction de l'efficacité de la connexion et du taux de sensibilité des cellules réceptrices, si moins de clones sont attendus, une partie du liquide de culture peut être aspirée après centrifugation (4000 RPM, 2 minutes), laissant une quantité appropriée de milieu de culture en suspension et tout ou une quantité appropriée enduite dans une plaque (le liquide restant enduit peut être conservé à 4 degrés, le jour 2 Si le nombre de colonies transformées est faible, tout le liquide restant peut être enduit d'une nouvelle plaque).

Dans Les plaques sont placées en avant à 37°c pendant 1 heure pour absorber l'excès de liquide, puis incubées à l'envers pendant une nuit.

5 Filtrer:

1). Criblage bleu - blanc des transformants:

Lorsque le fragment d'ADN exogène a été inséré dans pblue - t simple, le codage du gène lacZ a été modifié par la présence de la séquence d'acide nucléique de l'ADN exogène, ce qui a affecté son produit.b-Galactosidasea-L'activité du fragment, donc des clones Recombinants, apparaît en blanc sur la plaque X - gal / IPTG, alors que les clones non Recombinants apparaissent en bleu. Parfois, l'insertion d'un fragment n'affecte pas le cadre de lecture du gène lacZ, ou le fragment inséré est trop petit, auquel cas la colonie (clone recombinant) présente une couleur bleu pâle ou une tache bleue pâle au centre de la colonie, avec un anneau extérieur blanc (fish eye). Sélectionnez des colonies blanches ou bleues pâles cultivées sur des plaques IPTG / X - gal, sélectionnez - les avec un cure - dents sur un milieu liquide contenant du Penicillium ampicillium su et incuber à 37 ° C pendant une nuit.

2). Identification des transformants:

a. Les plasmides ont été extraits avec le liquide bactérien des colonies blanches cultivées ci - dessus, coupés enzymatiquement avec les sites enzymatiques portés par les fragments insérés et la taille des fragments a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose pour déterminer s'ils contenaient le fragment d'intérêt.

b. Sélection de colonies blanches directement pour la détection PCR

c. Le séquençage avec l'amorce promotrice T3 ou l'amorce de séquençage générique M13 a été utilisé pour déterminer si le clone cible était contenu.

Dans Comment calculer la quantité de produit PCR nécessaire dans la réaction de ligation?

Le rapport molaire du produit de PCR général au support optimisé à 2: 1 ~ 10: 1 (3: 1 recommandé) peut obtenir de bons résultats, la formule suivante peut être utilisée:

[quantité de vecteur d'insertion (ng) × taille du fragment d'insertion (KB) ÷ taille du vecteur (KB)] × rapport molaire du fragment d'insertion et du vecteur = quantité du fragment d'insertion (ng) par exemple: le rapport molaire entre le fragment d'insertion et la jonction du vecteur est de 3: 1, comme dans la réaction de ligation, le vecteur est ajouté 40 Ng et la taille du fragment d'insertion est de 1000 pb, la quantité de fragment d'insertion à ajouter est alors [40 ng de vecteur × 1 KB de fragment d'insertion ÷ 292 KB de vecteur] × 3 / 1 = 40,1 ng.

Principe du kit de clonage rapide tblue - t simple Vector T4