Cellules embryonnaires de saumon; CHSE-214

Nom du produit:Cellules embryonnaires de saumon; CHSE-214

Catégorie de produit: autres lignées cellulaires

Caractéristiques de croissance: Wall Grow

Système de culture: mem + 10% FBS, culture 28° ou 21°

Morphologie cellulaire: Cellule épithéliale comme

Spécifications: 1 × 10 ^ 6cells / bouteille de culture t25

Numéro de l'article: CS - c2905

Méthode de Cryoconservation des cellules:
Méthode de Cryoconservation 1: le tube de congélation est placé à 4 ℃ 30 ~ 60 minutes (- 20 ℃ 30 minutes *) - 80 ℃ 16 ~ 18 heures (ou la nuit) réservoir d'azote liquide VaporPhase pour le stockage à long terme.
Méthode de Cryoconservation II: le tube de congélation est placé dans le refroidisseur Programmable du programme défini, chaque minute tombe de 1 - 3 ℃ à - 80 ℃, puis dans le réservoir d'azote liquide Vapor phase de stockage à long terme. * - 20 ℃ ne doit pas dépasser 1 heure pour empêcher les cristaux de glace trop gros, provoquant la mort massive des cellules, ou sauter cette étape directement dans le réfrigérateur à - 80 ℃, mais la survie est légèrement réduite.

Le tissu épidermique est formé par l'ectoderme au cours de la période embryonnaire et a un effet anti - friction et anti - dommage. La technologie de l'entreprise fournit de l'ARN total de haute qualité, des brins d'adnc préparés par PCR, des protéines et leurs sous - composants à partir de tissus épidermiques fœtaux de rat frais ou congelés. Tous les produits sont soumis à un processus de QA / QC strict pour assurer leur qualité avant l'expédition. Ces produits peuvent être utilisés directement pour le clonage de gènes, l'analyse de profils d'expression et l'étude de diverses expériences de biologie moléculaire.
Préparation totale de l'ARN:Les ARN ont été isolés à l'aide du réactif trizol de qiagen rneasy Kit puis purifiés avec qiagen RNA Clean Kit. Les échantillons d'ARN total fournis par la société sont accompagnés de la concentration totale de l'échantillon d'ARN, du contenu total, des photos électrophorétiques, des résultats de détermination de la valeur OD, etc.

Préparation de l'adnc:L'ARN total purifié a été utilisé pour synthétiser les brins d'adnc en transcription inverse à 50 µl d'un système réactionnel total comprenant la transcriptase inverse MMLV et des amorces aléatoires ainsi que 10 mg d'ARN total. La réaction RT est terminée après 10 min de réaction à 68°c. Utilisez 1x RT buffer pour transporter l'adnc, 1 µl d'adnc est suffisant pour une réaction de PCR. Tous les produits cDNA sont soumis à une analyse QA / QC rigoureuse avant l'expédition de la commande, ce qui garantit la qualité du produit.

Préparation des protéines:Utilisation du modèle amélioré RIPA Buffer (50mMTris, pH7.2, 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 1% NP-40 , 1mM Na3VO4, 5mM NaF, 400uM PMSF, 1ug/ml of Pepstatin A, 5ug/ml of Aprotinin, 5ug/ml of Leupeptin) Des lysats de tissus épidermiques fœtaux de rat ont été préparés, les débris tissulaires ont été éliminés par centrifugation, la concentration en protéines a été déterminée par le kit de détection de protéines bio - rad, les protéines tissulaires diluées et conservées à - 80 degrés avec la protéine non réductrice buffer (50 mm tris - HCl, pH 6,8, 5% Glycerol, 1% SDS, 0002% bromphenol Blue) additionnée de 5% de bêta - mercaptoéthanol et de PMSF.

Applications potentielles: < 1 > clonage PCR de gènes connus; < 2 > épissage sélectif de l'ARNm; < 3 > clonage de gènes et séquençage de cibles; <4>Western and Northern Blot； < 5 > détection des protéines et protéomique; < 6 > carte de recherche et d'expression des puces.

Traitement cellulaire:

1) réanimer les cellules: Placez rapidement le lyophilisateur contenant 1 ml de suspension cellulaire dans un bain - Marie à 37 ° C (la surface de l'eau doit être inférieure au couvercle du lyophilisateur) secouez et décongelez, déplacez - le dans un tube à centrifuger de 15 ml préparé au préalable contenant 4 ml de milieu de culture et mélangez bien. Centrifuger 4 min à 1000 RPM, éliminer le surnageant et bien souffler après addition de 1 ml de milieu. Toutes les suspensions cellulaires sont ensuite transférées pour culture dans des flacons de culture contenant 5 ml de milieu pendant une nuit. Changez de liquide le lendemain et vérifiez la densité cellulaire.
2) Passage cellulaire: si la densité cellulaire atteint 80% - 90%, la culture de passage peut être effectuée.
Pour les cellules en suspension, le passage peut se référer aux méthodes suivantes:
Méthode 1: recueillir les cellules, 1000 RPM, centrifuger à température normale pendant 5 minutes, éliminer le surnageant, ajouter 1 - 2 ml de solution de culture après soufflage, distribuer la suspension cellulaire dans un nouveau récipient contenant 8 ml de milieu de culture dans un rapport de 1: 2 à 1: 5 ou flacon.
Méthode 2: la moitié de la solution peut être choisie, après avoir éliminé la moitié du milieu, les cellules restantes sont suspendues et la suspension cellulaire est divisée dans de nouvelles boîtes contenant 8 ml de milieu dans un rapport de 1: 2 à 1: 3 ou dans des flacons.
3) lyophilisation cellulaire: la lyophilisation cellulaire peut être effectuée lorsque la croissance cellulaire est en bon état. Lorsque les cellules en suspension sont congelées, les cellules doivent être collectées, 1000 RPM, centrifugées pendant 5 minutes à température normale, une petite quantité de surnageant est conservée (empêchant l'aspiration des cellules), une partie du milieu de culture frais est ajoutée, après un soufflage uniforme, ajoutée au lyophilisateur, dans lequel la lyophilisation est effectuée après agitation avec 10% de DMSO. Milieu de stockage congelé
Le milieu de lyophilisation recommandé doit être utilisé lors de la lyophilisation des cellules. Le milieu de lyophilisation doit contenir des cryoprotecteurs tels que le DMSO ou le glycérol. Un milieu de congélation * spécialement formulé peut également être utilisé.
1) le milieu de lyophilisation cellulaire est un milieu de lyophilisation prêt à l'emploi * pour les cellules de mammifères, dont les proportions de sérum de veau foetal et de sérum bovin sont optimisées pour améliorer la viabilité cellulaire ainsi que l'effet de la réanimation cellulaire Après décongélation.
2) le milieu de lyophilisation est un milieu de lyophilisation stérile, sans protéine, de composition chimique déterminée, contenant 10% de DMSO, adapté à la lyophilisation de nombreuses cellules souches et primaires (à l'exception des mélanocytes).
Processus opérationnel:
1.1 réactifs principaux vs instruments: microscope à contraste de phase inversé (Olympus IMT - 413, Japon), incubateur de CO2 (Yamato IT - 61, Japon).
1.2 culture de réanimation des cellules Hek - 293 et lyophilisation:
1.2.1 culture de réanimation des cellules retirer le lyophilisateur du réservoir d'azote liquide, le plonger immédiatement dans un bain - Marie à 37 °C et le secouer constamment pour le faire fondre rapidement. Le lyophilisateur de cellules dissoutes est retiré, ouvert après désinfection avec de l'alcool, le lyophilisateur de cellules dissoutes est aspiré, ajouté à l'intérieur du tube de centrifugation préalablement chargé en solution de culture (préchauffé à 37 ° C, 8 ~ 10 fois le volume), légèrement soufflé pour bien mélanger, puis 1000 RPM 5 min, le surnageant est éliminé, la quantité appropriée de solution de culture est ajoutée, la suspension cellulaire soufflée est ensemencée dans un flacon de culture de 25 cm 2 à une densité de 1 × 105 / ML, cultivée à 37 ° C, 5% CO 2 et humidité saturée.
1.2.2 passage des cellules culture primaire de cellules Hek - 293 48h changer de liquide 1 fois, les cellules poussent à 60% ~ 70% de fusion, digestion avec 0,25% pendant 1 ~ 2 min, le flacon de culture et la paume de la main tapotent doucement les cellules pour enlever la paroi, la suspension, la dispersion, afin de permettre la dispersion des cellules plus loin peut souffler doucement le tube plusieurs fois, obtenir une suspension cellulaire, puis ajouter une quantité multipliée de milieu de culture, mélanger doucement, pipette pour mélanger le mélange, passer les cellules amplifiées.
1.3 observation de la morphologie cellulaire la croissance et les caractéristiques morphologiques des cellules sont observées et enregistrées au microscope inversé.
1.4 comptage des cellules les cellules sont digérées de manière conventionnelle, à ce que les cellules soient arrondies, décortiquées et suspendues, centrifugées avec un peu de milieu de culture, puis remises en suspension de PBS et soufflées pour former une suspension cellulaire. Ajouter des traces de suspension cellulaire sur un côté de la lamelle de la plaque de comptage de cellules, en observant le nombre de cellules quadrangulaires quadrangulaires quadrangulaires de la plaque de comptage avec un objectif de 10 ×, le nombre de cellules a été calculé par la formule. Nombre de cellules / ml de liquide brut = (somme des nombres de cellules quadrilatères / 4) × 104.
1,5 taux d'adhérence des cellules cellules en phase exponentielle de croissance, digérées à 0,25% en suspension unicellulaire, après comptage, ensemencées séparément dans 12 flacons de culture de 25 cm 2, 3 flacons de cellules sont prélevés au hasard toutes les deux heures, le milieu de culture est aspiré et les cellules non adhérentes sont aspirées, les Enzymes pancréatiques sont ajoutées à la digestion, les cellules adhérentes sont comptées, leur moyenne est calculée selon la formule: taux d'adhérence (%) = (nombre de cellules adhérentes / nombre de cellules inoculées) × 100%.
1.6 croissance les cellules en phase exponentielle de croissance ont été transformées en suspension unicellulaire par digestion, ensemencées dans des plaques de 24 puits à 1 × 104 / puits, chaque puits étant additionné de 1 ml de milieu. 3 puits sont prélevés au hasard chaque jour, le nombre de cellules par puits est compté et la moyenne est calculée. Comptez 10D en continu et tracez la courbe de croissance cellulaire.

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Acifluorfene trifluorocarboxyléther boîte d'essai de détection d'anticorps contre la fièvre aphteuse ovine

D - ribose D - ribose 1,2,3 - tri [(CIS, CIS) - 9,12 - octadécadiénoyl] glycérol

Oleanolic acide 17β - Hydroxy - 4 - androstène - 3 - - 17 - ester
Extrait de tissu épidermique fœtal de ratLipase humaine A2 ELISA cassette ≥ 4190% as determined par SDS - page 2,5 - di - P - phénylène - di

Glucose mutase humaine ELISA cassette ≥ 4191% as determined par SDS - page 4 - chloro - 6 - yl - 5 - fluoropyrimidine

Inositol humain 3 kinase ELISA cassette ≥ 4192% as determined par SDS - page L - (+) - mandéline

Cassette ELISA de protéine kinase activée par adénosine humanisée ≥ 4194% as determined par SDS - Page N, n '- (4,4' - ylidènediphényl) bismaléimide

Kinase ELISA cartouche de régulation du signal extracellulaire humanisée ≥ 4195% as determined by SDS - page orthotrifluorobenzène

Protéine inhibitrice du facteur nucléaire Kappa B humanisée Alpha ELISA cassette ≥ 4196% as determined by SDS - page diylamino zinc de deuxième génération

Protéine kinase C humanisée ELISA cassette ≥ 4197% as determined par SDS - page 2,4,5 - triylthiazole

Fructose kinase humaine ELISA cassette ≥ 4198% as determined par SDS - page 6 - Hydroxy - 2 - Naphtalènesulfonate de sodium

Glycéromutase humaine 2 ELISA cassette ≥ 4199% as determined par SDS - page 4 - fluoro - 3 - ylbenzaldéhyde

Lymphokine humaine ELISA test Box ≥ 4200% as determined par SDS - page 2,3 - dipyridine

Lymphocyte humain Chimiokine ELISA test Box ≥ 4201% as determined by SDS - page base 3 - ester

Antigène lymphocytaire humain 6 complexe locus a ELISA cassette ≥ 4202% as determined by SDS - page sel de l'ester tertiaire de la L - Valine

Antigène lié à la fonction lymphocytaire humaine 3 ELISA cassette ≥ 4203% as determined by SDS - page 3,4,5 - trifluorobenzonitrile

Antigène lié à la fonction des lymphocytes humains 2 ELISA cassette ≥ 4204% as determined by SDS - page 4 - ylphenylboron

Rapport expérimental:
I. séparation et culture:
1, dans des conditions aseptiques, retirer le tissu auriculaire de rats SD d'âge 1 - 3D, puis laver ce bloc de tissu 2 fois avec du PBS, après quoi il sera d'environ 1 mm 3;
Ajouter 4 ml de digestat enzymatique (0,1% 0,1% collagénase de type I) dans le bloc de tissu, suspendre pendant 10 s, mettre à 37 ℃ pour la digestion pendant 10 min, après quoi souffler avec un compte - gouttes pour faire une suspension unicellulaire, précipiter naturellement et recueillir le surnageant, mettre 4 ℃ après la fin de la digestion avec un milieu contenant 10% de FBS;
3, le tissu restant est ajouté 3 ~ 4 ml de digestat enzymatique, suspendu pendant 10 s, après la digestion à 37 ℃ pendant 10 min, selon la méthode ci - dessus pour recueillir le surnageant et terminer la digestion après 4 ℃ placer, répétez cette étape 2 - 3 fois jusqu'à ce que le tissu * soit digéré;
4, filtrer le digestat cellulaire avec un tamis en acier inoxydable de 200 Mesh, centrifuger à 1200r / min pendant 10 min, éliminer le surnageant, les cellules précipitées sont suspendues avec du milieu contenant 10% de FBS dmem / F12, ensemencées dans des flacons de culture de 25 cm 2, placés à 37 ° C, incubés Dans un incubateur à 5% de CO2;
5, après l'application différentielle de la paroi 1H, le milieu de culture est aspiré et la culture continue comme l'expérience nécessite l'ensemencement dans une plaque de 6 puits;
II. Identification par immunofluorescence:
1, à la croissance des myocytes auriculaires à 80% de fusion, le milieu de culture est abandonné et les cellules sont rincées 2 fois avec du PBS incubé pendant 10 min, puis les cellules sont fixées avec du paraformaldéhyde à 4% pendant 15 min à température ambiante;
2, PBS rincer les cellules 2 fois pendant 10 min, puis à 4 ° c Avec 0,1% Triton X - 100 perméable pendant 15 min;
3, PBS rincer les cellules 2 fois, chaque fois pendant 10 min, puis dans des conditions de température ambiante, fermer les cellules avec BSA 4% pendant 30 min;
4, diluer alpha - Actin un anti dans un rapport de 1: 100, puis placez - le dans un réfrigérateur à 4 ° C pour incuber les cellules pendant la nuit;
5, PBS rincer les cellules 3 fois, chaque fois pendant 10 min, diluer le bis - anti - alpha - actine dans un rapport de 1: 150, 37 ℃ condition de laisser 1 h;
6, rincer 3 fois avec du PBS pendant 10 min, puis observer l'image sous un microscope à fluorescence inversé et prendre des photos.