Toledo cellules humaines diffuses de lymphome à grandes cellules B

Toledo cellules humaines diffuses de lymphome à grandes cellules B

Introduction aux cellules

Toledo est une lignée de lymphocytes B isolée en 1990 à partir du sang périphérique de patientes blanches adultes atteintes de lymphome diffus à grandes cellules (cellules B non hodgkiniennes). Après de fortes doses de Liao quantifié et une greffe de moelle osseuse, le patient a ensuite développé un lymphome cérébral. Bien que la morphologie des cellules ressemble à celle du lymphome de Burkitt, les cellules manquent de la translocation chromosomique typique du lymphome de Burkitt. Le caryotype présente en effet plusieurs aberrations chromosomiques. Les cellules n'expriment pas les immunoglobulines de surface ou cytoplasmiques. Ces cellules sont négatives pour le virus Epstein - Barr.

Caractéristiques des cellules

1) Source: lymphocytes B isolés dans le sang périphérique de femmes blanches adultes

2) morphologie: lymphoblastoïde comme la croissance en suspension

3) Contenu: > 1x106 nombre de cellules

4) Spécification: bouteille de t25 ou paquet de lyophilisateur de 1ml

5) Utilisation: utilisation scientifique seulement.

Transport et conservation

Transport de glace sèche et réanimation de bonnes cellules viables

(1) 1ml conteneur de stockage de congélation pour le transport de la glace sèche, après réception - 80 degrés de conservation du réfrigérateur pendant la nuit après le transfert à l'azote liquide ou la réanimation directe, s'il s'avère que la glace sèche a été volatilisée propre, le bouchon du conteneur de stockage de congélation est tombé, cassé et les cellules sont contaminées, s'il vous plaît contactez - nous immédiatement.

(2) Les cellules viables réanimées par le flacon t25 sont expédiées à température normale, après réception, en suivant la méthode de traitement après réception cellulaire.

Traitement après réception cellulaire

1) après avoir reçu les cellules, la paroi de la bouteille de désinfection de l'alcool à 75% place la bouteille t25 dans l'incubateur à 37 ℃ pendant environ 2 - 3H, si vous trouvez la bouteille de culture cassée, il y a un déversement de liquide et la contamination des cellules, s'il vous plaît contactez - nous rapidement après avoir pris des photos.

2) s'il vous plaît confirmer l'état des cellules sous un microscope 4 ou 5X, tout en prenant des photos des cellules fraîchement reçues (10 ×, 20 ×) 2 - 3 de chaque ainsi qu'une photo de l'apparence du flacon de culture à retenir comme base de l'état des cellules au moment de la réception Après - vente.

3) cellules collées: les cellules sont placées dans l'incubateur à 37 ℃ pendant 2 - 3H, sous le microscope pour observer la croissance des cellules et l'application de la condition, certaines cellules collées dans le processus d'expédition Express tomberont en raison de la vibration et de la condition de la masse après la chute. Si la densité de croissance des cellules observées sous miroir est inférieure à 60%, le milieu de perfusion peut être retiré du flacon de culture (s'il y a des cellules non collées qui doivent être récupérées par centrifugation, remises en suspension dans le flacon de culture d'origine), ajouter 6 - 8 ml de milieu Quan fini nouvellement formulé et mettre dans l'incubateur de cellules pour poursuivre la culture. Si la densité de croissance cellulaire est supérieure à 70% - 80%, les cellules peuvent être traitées par passage. Pendant le passage, si les cellules tombées en raison des vibrations de transport doivent être récupérées par centrifugation.

4) Remarque: le milieu utilisé pour le transport (milieu de culture de perfusion) ne peut plus être utilisé pour la culture des cellules, veuillez remplacer le milieu Quan fini fraîchement formulé selon les conditions de culture cellulaire des instructions pour la culture des cellules. Un passage après la réception des cellules est recommandé pour les flacons de culture t25 1: 2 passage.

Toledo cellules humaines diffuses de lymphome à grandes cellules B

Préparation du milieu de culture et des conditions de congélation

1) Préparer le milieu rpmi - 1640 (icell - 0002 recommandé); Sérum de veau foetal de haute qualité, 10%; Double résistance, 1%.

Remarque: les cellules sont resuspendues avec le milieu complet recommandé et distribuées dans des flacons de culture t25. Il est très important d'éviter une alcalinité trop élevée du milieu de culture lors de la récupération cellulaire. Il est recommandé de placer le récipient de culture contenant le milieu de croissance totale dans l'incubateur pendant au moins 15 minutes avant d'ajouter le contenu du flacon afin que le milieu atteigne un pH normal (7,0 à 7,6).

2) conditions de culture: phase gazeuse: air, 95%; CO2, 5%. Température: 37 degrés Celsius, l'humidité de l'incubateur est de 70% - 80%.

3) lyophilisat: 90% sérum, 10% DMSO, maintenant utilisé avec un dosage actuel.

II. Traitement cellulaire:

1) réanimation des cellules lyophilisées:

Le lyophilisateur contenant 1 ml de suspension cellulaire est décongelé sous agitation rapide dans un bain - Marie à 37°c, ajouté à un tube à centrifuger contenant 4 à 6 ml de milieu Quan fini pour bien mélanger. Centrifuger à 1000 RPM pendant 3 - 5 min, éliminer le surnageant et terminer la remise en suspension des cellules dans le milieu Quan. La suspension cellulaire est ensuite incubée à 37°c pendant une nuit dans des flacons (ou boîtes) contenant 6 - 8 ml de milieu Quan fini. La croissance cellulaire et la densité cellulaire sont observées au microscope le lendemain.

2) Passage cellulaire: si la densité cellulaire atteint 80% - 90%, la culture de passage peut être effectuée.

Pour le passage de cellules adhérentes, on peut se référer aux méthodes suivantes:

1. Jeter le surnageant de culture et laver les cellules 1 - 2 fois avec du PBS sans ions calcium et magnésium.

Ajouter 0,25% (P / v) de la protéine pancréatique Mei - 0,53 mm EDTA dans des flacons de culture (flacon t25 1 - 2 ml, flacon T75 2 - 3 mL), placer dans un incubateur à 37 ° C pour digérer jusqu'à ce que les couches cellulaires soient dispersées (généralement en 5 à 15 minutes) pour permettre au milieu d'atteindre un pH normal (7,0 à 7,6), puis observer la digestion des cellules au microscope, pour éviter les grumeaux, ne pas battre ou secouer le flacon en attendant la séparation des cellules pour agiter les cellules. Les cellules difficiles à isoler peuvent être portées à 37°c pour favoriser la dispersion. Si la plupart des cellules sont arrondies et tombent, retournez rapidement à la table d'opération et ajoutez 3 - 4 ml de milieu contenant 10% de FBS après quelques clics sur le flacon de culture pour terminer la digestion.

3. Bien mélanger doucement et bien aspirer, centrifuger à 1000 RPM pendant 3 - 5 min, jeter le surnageant, ajouter 1 - 2 ml de solution de culture et bien souffler. La suspension cellulaire est divisée dans de nouveaux flacons t25 dans un rapport de 1: 2, 6 - 8 ml de nouveau milieu complet Wan configuré selon les instructions sont ajoutés pour maintenir la viabilité de croissance des cellules, et les passages suivants sont effectués dans un rapport de 1: 2 ~ 1: 5 selon la réalité.

3) lyophilisation cellulaire: après réception des cellules, il est recommandé de lyophiliser un lot de semences cellulaires pour une utilisation expérimentale ultérieure au cours des 3 premières générations de culture.

La bouteille t25 ci - dessous à titre d'exemple;

1. Les cellules sont congelées en suivant le processus de passage des cellules pour collecter les cellules bien digérées dans le tube de centrifugation, qui peut être compté à l'aide de la plaque de comptage des globules pour déterminer la densité de stockage des cellules congelées. La densité de lyophilisation recommandée pour les cellules générales est de 1 × 10 ^ 6 ~ 1 × 107 cellules vivantes / ML.

2. Centrifuger à 1000rpm pendant 3 - 5min, enlever le nettoyage supérieur. Remettre les cellules en suspension avec le lyophilisat cellulaire formulé, chaque ml de lyophilisat contenant 1 × 10 ^ 6 ~ 1 × 107 cellules vivantes / ML dans un lyophilisateur distribuer les cellules dans un lyophilisateur, étiqueter avec le nom, l'algèbre, la date et d'autres informations.

3.placez les cellules à conserver congelées dans une boîte de refroidissement programmée, - 80 degrés réfrigérateur pendant la nuit, après quoi transférer dans un récipient d'azote liquide pour le stockage. La position du bon réservoir de congélation dans le réservoir d'azote liquide est enregistrée simultanément pour une consultation et une utilisation ultérieures.