T - Vector Colony PCR Identification Kit T4 principe vecteur

Kit universel d'identification PCR des colonies de vecteurs t

T - Vector Colony PCR Identification Kit T4 principe vecteur

Numéro de catalogue:42015

Composition du kit, stockage, stabilité:

Stockage:-20 ℃ 保存。

Introduction du produit:

La coloniela PCRL'identification estTUn moyen pratique et rapide d'identifier s'il y a des clones positifs (avec des fragments insérés) zui après ligation de clone de vecteur. Mais les colonies visibles sur le marchéla PCRLes kits d'identification sont tousT3, T7ouSP6Etc. spécifiqueTAmorces porteuses, qui ne peuvent être utilisées que pour une certaine spécificitéTIdentification des clones positifs pour la liaison vectorielle. Si l'utilisation est différenteTTransporteur, il est nécessaire d'acheter plusieurs kits d'identification en même temps, ce qui augmente considérablement le coût d'utilisation. Cette société adopte UniversalTGénérique pour le développement d'amorces porteusesTColonies de porteursla PCRKits d'identification, il suffit d'acheter un kit qui peut être utilisé pour tous les communs sur le marchéTLe porteur(inclurepGEM,pUC,pBluescriptsérie) etIdentification des clones positifs liés. En outre, l'adoptionT3, T7ouSP6Faire une colonie d'amorcesla PCRLes amorces du kit d'identification sont à très courte distance du site d'insertion, donc dans l'identification100bpLors de l'insertion d'un fragment gauche - droite ou d'un fragment plus petit, les bandes dimères d'amorce des clones négatifs et les bandes amplifiées des clones positifs sont de tailles proches et ne peuvent être distinguées. Souvent, les bandes de dimères d'amorce sont considérées comme des bandes d'amplification positives, ce qui entraîne des faux positifs. Au contraire, provoquer un faux négatif. Ce kit est universelTLa distance de l'amorce porteuse lorsqu'aucun fragment n'est inséré a au moins150bpCe qui précède, ajouté à la longueur du fragment inséré, permet de distinguer clairement si c'est la bande amplifiée par le fragment inséré ou la bande amplifiée par le dimère d'amorce. Éviter les faux positifs ou les faux négatifs améliore considérablement la précision.Un tube portable développé par Notre sociétéPCR MasterMixSystème de prémélange, vous n'avez pas besoin d'ajouter divers ingrédients un par un, ajouter directement besoin de filtrer les monocolonies, après1Heures environla PCRLa détection réactive et électrophorétique permet d'obtenir les résultats de l'identification des colonies recombinantes.

Fragments amplifiés attendus:

Précautions:

1. Lors de l'identification des colonies recombinantes, avant de sélectionner une seule colonie, il convient de bien marquer, ce qui facilite l'utilisation après l'identification.

2. Lors de la sélection des colonies, il faut choisir une seule colonie, ne pas sélectionner trop de colonies, afin de ne pas affecterla PCRRésultats.

3. paramétragela PCRLorsque vous procédez, décidez du temps d'extension en fonction de la taille du fragment inséré, si la taille du fragment inséré est1 koCi - dessous, le temps d'extension30 à 45Les secondes suffisent, si le segment est plus long, le temps d'extension peut être augmenté dans cette proportion.

Les étapes opérationnelles (pour25mlPar exemple, les clients peuvent également adopter20mlSystème):

{C}1. Combiner les amorces selon le système suivant1 x Taq MasterMixLiquide réactionnel.

2. Après numérotation des colonies sur les plaques cultivées pendant la nuit, une partie des colonies individuelles est ajoutée au liquide réactionnel ci - dessus à l'aide d'une tête de pistolet stérilisée, le mélange par soufflage permettant une dispersion adéquate des colonies dans le liquide réactionnel.

Un tube supplémentaire de contrôle négatif sans colonie peut être réglé pour faciliter l'analyse des résultats expérimentaux.

3. Serala PCRLe tube est placé sur le thermocycleur pour démarrer la réaction dans les conditions suivantes, les conditions recommandées étant les suivantes:

94℃10 minutes

94℃30 secondes

55℃30 sec 30-33 cycles

72℃0,5 à 1 min

72℃5 minutes

Remarque: Veuillez ajuster la durée d'extension en fonction de la taille du fragment inséré. Le temps de pré - dénaturation est prolongé jusqu'à10Minutes, principalement pour lyser les colonies, la libérationADNLe template.

Une fois la réaction terminée, prenez5 à 10mlDétection par électrophorèse directe.

Remarque: si la bactérie est difficile à lyser ou si les impuretés sont Multi - faux négatifs, essayez la méthode ci - dessous et la lyse est libérée.ADNEffectué après.

1. Pick colonie ajouter 50ml jourL’eau (ou10ml jourDans l'eau), vibrant.

2. 99Degrés,10Minute inactive les enzymes dans le liquide bactérien et libèreADN- Oui.

3. 12000rpmCentrifugation1Minutes pour enlever les débris cellulaires.

4. Prenez le nettoyagela PCR,25ml PCRLe système prend5mlUpper clearing (début50ml jourEau), ou1mlUpper clearing (début10ml jourEau) pour faire le modèle.

T - Vector Colony PCR Identification Kit T4 principe vecteur