I. Transfert d'échantillons: éviter la contamination et les pertes

Lors du transfert de l'échantillon de l'échantillonneur vers un récipient de traitement (boîte de pétri, tube de centrifugation, par exemple), il est nécessaire de protéger simultanément contre la contamination extérieure et la perte de micro - organismes cibles:

Fonctionnement en environnement stérile:

Le transfert doit être effectué dans une armoire de sécurité biologique, désinfecter la tête d'échantillonnage, la surface du récipient et les mains de l'opérateur avec de l'alcool à 75% avant l'opération; Utilisez une paille stérile, un pistolet à pipette (la tête du pistolet doit être stérilisée) et évitez tout contact avec des zones non stériles (par exemple, la paroi extérieure du récipient).

Conseil d'erreur: Si vous travaillez dans un environnement ouvert, les hétéroclites dans l'air peuvent se mélanger dans l'échantillon, ce qui entraîne un nombre de colonies élevé, en particulier pour les échantillons à faible concentration.

élution adéquate du liquide d'échantillonnage:

Dans le cas des échantillonneurs à percussion et à tamis, la tête de prélèvement doit être rincée à plusieurs reprises (au moins 3 fois) après le prélèvement avec un éluant stérile (p. ex. sérum physiologique stérile à 0,85%, tampon phosphate PBS), en veillant à ce que les micro - organismes fixés pénètrent complètement dans l'éluant; Le vortex oscille pendant 1 ~ 2 minutes (vitesse de rotation 2000 ~ 3000rpm) pour briser la microflore qui s'accumule et améliorer la dispersion.

II. Dilution de l'échantillon: garantir la précision des multiples de dilution

Lorsque la concentration de micro - organismes dans l'échantillon est élevée, la dilution du gradient est nécessaire pour obtenir un nombre de colonies dénombrable (30 ~ 300 CFU / boîte), l'erreur du processus de dilution affecte directement la précision des résultats:

Diluant et récipient: utiliser un tube de dilution à gradient stérilisé (par exemple un tube à essai à bouchon à vis d'une capacité de 10 ml) avec 9 ml de diluant stérile préinstallé (erreur requise ≤ ± 0,1 ML); Marquez clairement les multiples de dilution (10⁻¹, 10⁻², etc.) pour éviter toute confusion.

Spécifications opérationnelles:

Assurez - vous que la pointe de la paille / tête de pistolet touche 1 ~ 2cm sous le niveau liquide lors du pipetage, évitez d'inhaler des bulles d'air;

Lors de la dilution de haute à basse concentration, chaque étape doit être mélangée (frotter le tube à essai 10 ~ 15 fois avec vos mains), pour assurer une dilution uniforme;

Le même multiple de dilution fait 2 ~ 3 échantillons parallèles, réduisant l'erreur aléatoire.

Iii. Culture et comptage: contrôle des conditions de culture, spécification des normes de comptage

La croissance des micro - organismes est fortement influencée par les conditions de culture et nécessite une stricte harmonisation des paramètres:

Sélection et préparation du milieu:

Sélectionnez le milieu de culture en fonction du type de micro - organisme cible (par exemple, gélose nutritionnelle pour détecter les bactéries, gélose au glucose de pomme de terre PDA pour les champignons), le milieu de culture doit être soigneusement stérilisé (autoclave à la vapeur à 121 ℃ pendant 20 minutes) et le pH est conforme aux Exigences (bactéries pH 7,2 ~ 7,4, champignons pH 5,6 ~ 5,8) pour éviter que les micro - organismes ne puissent se développer en raison de carences nutritionnelles ou d'inconfort acido - basique.

Contrôle des conditions de culture:

Température: bactéries 36 ± 1 ℃, champignons 28 ± 1 ℃, incubateur thermostatique nécessite une température d'étalonnage quotidienne (erreur ≤ ± 0,5 ℃);

Durée: 48 ± 2 heures pour la culture bactérienne et 72 ± 2 heures pour la culture fongique, en évitant les cultures trop courtes conduisant à des fuites de colonies ou trop longues conduisant à des chevauchements de colonies.

Règles de comptage:

Sélectionnez le nombre de colonies à 30 ~ 300cfu pour le comptage de la plaque (en dessous de 30, l'erreur de résultat est grande, au - dessus de 300, les colonies se chevauchent facilement);

Si la différence entre le nombre de colonies de plaques parallèles pour la même dilution est supérieure à 1 fois (par exemple, 20 et 50 colonies de plaques pour une dilution de 10⁻³), il faut procéder à une nouvelle détection;

Lors du comptage, il est nécessaire de distinguer les micro - organismes cibles des bactéries contaminantes (qui peuvent être jugées à l'aide de la morphologie des colonies, de la chromatographie).

Iv. Contrôle de qualité: vérifier la fiabilité tout au long du processus

Expériences de contrôle à blanc:

Lors du traitement de chaque lot d'échantillons, les blancs d'échantillonnage sont fixés (l'échantillonneur ne prélève pas d'air, la tête d'échantillonnage est uniquement rincée avec de l'éluant après la culture) et les blancs opérationnels (l'éluant stérile est ensemencé directement dans la culture), si le nombre de colonies vierges est > 5 UFC, indiquant la présence de contamination, une nouvelle expérience est nécessaire.

Contrôle positif versus vérification du taux de récupération:

Le taux de récupération doit être compris entre 70% et 130%, sinon l'efficacité de l'échantillonneur ou le processus de traitement doit être vérifiée, en simulant régulièrement l'échantillonnage avec des concentrations connues de liquide bactérien standard (par exemple E. coli, Staphylococcus aureus).

Calibration des instruments:

L'échantillonneur doit régulièrement calibrer le débit (erreur ≤ ± 5%) pour éviter les écarts de volume d'échantillonnage dus à l'incertitude du débit;

Le pistolet à pipette, l'incubateur et d'autres équipements doivent être certifiés métrologiques chaque année, ce qui garantit que les paramètres sont exacts.