Selon les statistiques, près de80%Les matières organiques et inorganiques peuvent être séparées par chromatographie liquide à haute performance, dans laquelle la chromatographie en phase inverseC18Les colonnes de chromatographie sont la classe de colonnes de chromatographie la plus couramment utilisée en chromatographie liquide à haute performance. Ci - dessous.C18Une introduction à la sélection, l'entretien et la réparation de la colonne de chromatographie.

Un,C18Choix des colonnes

C18Principales considérations concernant le choix2Un problème, à savoir l'effet du remplissage de la colonne et les spécifications de la colonne sur la colonne de chromatographie.

Les propriétés physiques de la charge de colonne ont une influence importante sur le comportement chromatographique de la charge. Les principales propriétés physiques de la charge sont les suivantes: granulométrie, taille des pores, volume des pores, chimie de la phase de liaison, teneur en carbone et traitement d'alkylation.

(1)La granulométrie fait référence à la taille du diamètre des particules du remplissage de la colonne. En effet, la taille des particules visée sur la colonne chromatographique est une valeur moyenne. Comme la taille des particules »5μmPas tous les diamètres de particules de remplissage dans la colonne sont5μmIl y a en fait une distribution de particules. Cette distribution joue un rôle important dans la contre - pression de la colonne et l'effet de la colonne. En général, plus la granulométrie moyenne est faible, plus la distribution des particules est faible, plus l'efficacité de la colonne chromatographique est élevée et plus la pression inverse est élevée. ActuellementC18Colonne de remplissage granulométrie en4à10μmEntre.

(2)Le diamètre des pores fait référence à l'espace poreux entre les particules de remplissage. Par diamètre de pore en général, on entend le diamètre moyen des pores de la garniture. La distribution moyenne des pores après la colonne de remplissage sphérique est relativement étroite, la structure du lit de colonne est uniforme, l'efficacité de la colonne est élevée et la reproductibilité est bonne; La distribution moyenne des pores du remplissage amorphe est large, la structure du lit de colonne n'est pas uniforme, la vitesse linéaire de la phase d'écoulement n'est pas uniforme et la bande spectrale est élargie. La taille moyenne des pores a un impact important sur la séparation des composés macromoléculaires et peut avoir un effet d'exclusion moléculaire lors de la séparation d'échantillons contenant de plus grandes molécules ou produire un effet d'adsorption qui affecte la récupération quantitative et la précision. Par conséquent, lors de la séparation d'échantillons tels que des protéines ou des Polypeptides par chromatographie en phase inverse, il convient d'envisager d'utiliser de grandes tailles de pores.(Comme30 nm)Remplissage de colonne en phase inverse. Le volume poreux en tant que paramètre de la porosité du gel de silice, peut être utilisé comme référence lors de l'analyse séparée de composés moléculaires plus importants, en choisissant un volume poreux plus important de la colonne de remplissage inverse.

(3)Les charges de phase de liaison chimique occupent une place extrêmement importante dans la chromatographie liquide à haute performance. Il peut lier des groupes organiques plus polaires, en utilisant un solvant moins polaire comme phase mobile. On peut également lier des groupes organiques moins polaires et choisir comme phase mobile un solvant plus polaire.C18La colonne chromatographique est du type lié par silylation(Si-O-Si-C)Existant, ce type de réaction de liaison est actuellement le plus couramment appliqué. Tels que l'octadécyltrichlorosilane avec du gel de silice de type polyporeux completM-Porasil-C18La réaction génère une phase de liaison chimique alkyle, connue sous le nom commercial deM-Bondapak-C18- Oui.

(4)La teneur en carbone est la quantité de carbone contenue dans la charge. La technique de mesure traditionnelle consiste à chauffer la charge jusqu'à rupture des liaisons hydrocarbonées, puis à calculer la teneur en carbone en déterminant le poids perdu ou le dioxyde de carbone formé. La teneur en carbone peut être augmentée en augmentant la longueur des liaisons carbonées ou en augmentant la densité de liaison. La teneur en carbone augmente et la valeur de rétention de la colonne augmente. Le comportement chromatographique de la phase de collage est lié à la densité de collage, mais aussi à la densité du gel de silice et à la surface de la charge, plus la densité de la charge est élevée, plus la quantité de gel de silice nécessaire pour remplir la colonne est importante et plus la teneur en carbone de la colonne est élevée. Si utilisé2Des charges de densité différente avec la même teneur en carbone remplissent les colonnes, leur comportement de rétention sera nettement différent. Il ne suffit donc pas de prédire le comportement chromatographique seul en termes de teneur en carbone.

(5)C18Le réactif de silylation est un plus grand que2 nmMacromolécule, donc sera lié à un groupe Silanol adjacentC18Le réactif de silylation produit une stéréorésistance sévère. Il en résulte un grand nombre de groupes silanols résiduels à la surface du gel de silice qui n'ont pas réagi avec le réactif de silylation, et ces groupes silanols polaires qui, dans certaines conditions chromatographiques, interagissent avec les composés basiques provoquent un glissement en crête qui peut influencer les résultats de l'analyse quantitative. Ces problèmes peuvent être surmontés dans une certaine mesure par un traitement d'alkylation. Le traitement d'alkylation est une réaction indépendante réalisée sur la phase de collage pour réduire les groupes silanols à la surface du gel de silice. Traitement d'alkylation par petites molécules(Comme le trisilane) etLes réactifs, dont la résistance spatiale est bien inférieure àC18Le Groupe. La plupart des phases fixes seulement30%Position de collage pouvant être couverte. La couverture la plus élevée est rapportée par certains agents chimiques extrêmement actifs et des conditions de réaction spéciales50%. une bonne connaissance des caractéristiques physiques de la phase de liaison du gel de silice aidera à sélectionner la colonne chromatographique appropriée dans la réaction de chromatographie liquide à haute performance. Vue en surfaceC18Colonnes bien que les fonctions chimiques sont les mêmes, alors qu'en fait différentes marquesC18Les performances de la colonne peuvent varier considérablement, ce qui donne des résultats de séparation différents.

Le choix du remplissage de la colonne est lié à la possibilité de séparation chromatographique, tandis que le choix des spécifications de la colonne affecte directement la vitesse d'analyse, la capacité de séparation, la capacité de détection et la consommation de solvant par analyse. La spécification de la colonne comprend deux aspects: le diamètre intérieur de la colonne et la longueur de la colonne. Diamètre intérieur de la colonne, type analytique généralement2à6 mm,Type de préparation20 mmLe grand peut atteindre80 mm; longueur de la colonne, type analytique5à30 cm, type de préparation15à50 cm. en général, le diamètre interne de la colonne n'affecte pas le degré de séparation par rapport au temps d'analyse. Aujourd'hui, la technologie des colonnes a évolué pour que des colonnes de diamètres internes différents puissent avoir les mêmes performances. Les colonnes de diamètre intérieur différent ont chacune des caractéristiques, pour le même temps d'analyse et le même degré de séparation, les colonnes de grand diamètre intérieur consomment plus de solvant que les colonnes de petit diamètre intérieur. D'autre part, les colonnes de plus petit diamètre intérieur nécessitent moins d'échantillons pour le même signal de détection. Par conséquent, il y a * dans la quantité d'échantillon, une petite colonne de diamètre intérieur peut être utilisée. Bien que l'augmentation de la longueur de la colonne améliore l'effet de séparation, la résistance augmente également et la pression d'entrée doit être augmentée. La pression de la colonne est un obstacle majeur qui affecte simultanément l'augmentation de la séparation et la réduction du temps d'analyse. Le degré de séparation, le temps d'analyse et la pression de colonne sont tous trois conditionnés l'un par rapport à l'autre, bien choisir les deux, puis3Un facteur est également choisi. La colonne longue peut donner un degré de séparation élevé, la colonne courte peut fournir une séparation rapide, nous pouvons choisir la colonne de chromatographie appropriée en fonction de la situation de l'échantillon.

C18Principes de base du choix des colonnesPour:

(1)Le choix d'une charge ayant subi un traitement d'alkylation des bouchons permet d'éviter le phénomène de traîne des composés basiques.

(2)Choisissez des colonnes à haute teneur en carbone, augmentant la valeur de rétention.

(3)Choisir des colonnes plus courtes(Comme15 cm,7,5 cm)- Oui.

(4)Choisissez un remplissage de petite granulométrie.

(5)Pour les composants de poids moléculaire élevé, on choisit des colonnes avec une garniture de grande taille de pores.

Deux,C18Utilisation et entretien quotidiens des colonnes

Dans le travail quotidien d'analyse de séparation, si la colonne de chromatographie est utilisée correctement affecte directement la durée de vie de la colonne de chromatographie. Présentation ci - dessousC18Ce que la colonne doit faire attention pendant l'utilisation quotidienne.

(1)Les colonnes lors du chargement et du déchargement, du remplacement, l'action doit être légère et le serrage des joints doit être modéré. Les fortes vibrations mécaniques doivent être évitées afin que le lit de la colonne ne crée pas de vide.

(2)Si l'instrument est utilisé pour l'analyse de routine, les types d'échantillons sont limités, mais le nombre d'analyses est élevé, il peut être utile de configurer pour chaque catégorie d'analyse de routine.1Colonne spécifique à la racine, ce qui contribue à prolonger la durée de vie de la colonne.

(3)Comme lors de l'utilisation d'un dispositif de contrôle de la température de la colonne, il faut prendre soin de ne pas se réchauffer après passage dans la phase mobile.

(4)La phase mobile doit être dégazée avant l'utilisation, afin de ne pas réduire l'efficacité de la colonne et affecter la détection, etc. La solution de l'échantillon doit être correctement traitée et filtrée pour réduire la contamination et le colmatage de la colonne.

(5)Lors du remplacement des espèces en phase mobile, il convient de prêter attention à l'intersolubilité du solvant et d'éviter le phénomène de salinisation.

(6)La pression de fonctionnement réelle de la colonne doit être inférieure à la pression maximale au moment du remplissage, de préférence inférieure à la moitié de la pression maximale. Généralement pas plus de20 593 965à29 419,95 kPa. à basse pression(≤14 709,975 kPa)L'utilisation de la gamme, peut permettre à la colonne de maintenir un effet de colonne élevé pendant une longue période.

(7)C18Colonne de chromatographie genre colonne de chromatographie à phase liée non polaire, en phase mobileLe pHLes valeurs doivent être strictement contrôlées dans2à7Entre, afin de ne pas endommager la colonne.

(8)Après avoir terminé le travail d'analyse de séparation, il ne devrait pas être immédiatement arrêté, le système d'analyse chromatographique doit être rincé à temps, général0,5 hCi - dessus pour éliminer les impuretés à l'intérieur de la colonne de chromatographie.

(9)S'il y a du sel dans la phase mobile, lavez - le d'abord abondamment avec de l'eau. Si c'est une amine(Comme la triméthylamine ou la tétrabutylamine) etAjouter à la phase fluide, pour utiliser50%Méthanol et0,05%Solution d'acide phosphorique mélanger le solvant pour rincer, ne pas rincer uniquement avec de l'eau.

(10)C18Le méthanol est généralement utilisé comme solvant de conservation pour empêcher les colonnes de se fissurer et d'être endommagées. Il est strictement interdit de retenir de l'eau ou des solutions tampons dans le flux chromatographique pendant de longues périodes.

(11)Choisir le bonC18Protection de la colonne pour protéger la colonne d'analyse des particules d'impuretés et des perturbateurs irréversiblement adsorbés. La granulométrie du remplissage intérieur de la colonne de protection doit être aussi cohérente que possible avec la granulométrie du remplissage de la colonne d'analyse.

(12)La durée de conservation de la colonne ne doit pas être trop longue. Inutile à court termeC18Colonne, rincée au méthanol30à60 minutes, puis sceller les deux extrémités de la colonne. Les colonnes qui ne sont pas utilisées à long terme, l'un est de prendre un rinçage régulier, la méthode de scellement; Deux après le rinçage, chaque extrémité de la colonne est chargée1Récipients remplis de méthanol d'une certaine capacité seulement(Une seule extrémité est également disponible) et, pour compléter l'évaporation du solvant à l'intérieur de la colonne lors d'un stockage plus long.

Trois,C18Réparation de colonnes

Colonne de chromatographie dans l'utilisation quotidienne, malgré la protection stricte, l'échantillon et la phase mobile malgré le traitement préalable, mais après une longue période d'utilisation, il est encore difficile * d'éviter la contamination de la colonne, la perte de phase stationnaire, la jonction de plaques, l'effondrement du lit de colonne et la diminution de l'efficacité de la colonne, etc. Certains peuvent être réparés pour restaurer une partie de l'effet de la colonne.

1,Technologie de régénération de la pollution des colonnes

Après contamination de la colonne de chromatographie, on peut rincer avec un solvant approprié pour régénérer l'effet de la colonne.C18Les méthodes classiques de lavage régénératif de la colonne sont: respectivement avec du méthanol, du trichlorojianeLe méthanol/ chaque eau60 mLPasser successivement sur colonne chromatographique puis méthanol60 mLAprès l'équilibrage de la colonne de chromatographie est scellé, l'effet de la colonne reviendra à la normale. Si nécessaire, selon la nature de la contamination de la colonne(Comme la pollution organique, la pollution par les sels, etc.) et, adopté0,05 mol/L H2SO4Et,0,5 mol/L H3PO4ou0,1 mol/L EDTALe sel de sodium est rincé puis rincé à l'eau et enfin séquestré après équilibrage de la colonne de chromatographie avec du méthanol. Pour une pollution sévèreC18La colonne, peut être rincée à l'eau, au méthanol, au chloroforme, à l'éthane dans l'ordre, après inversion et rinçage1Une fois, chaque fois que le solvant utilisé60 mL, le détecteur n'est pas connecté et enfin scellé avec une colonne de chromatographie équilibrée au méthanol.

2,Réparation de la contamination des colonnes

Lorsque la régénération de la contamination de la colonne n'est pas efficace ou que la contamination de la colonne est connue pour être grave, la méthode de réparation de la colonne peut être appliquée, mais la profondeur de contamination de la colonne ne doit pas dépasser5 mm.La méthode consiste à creuser la partie contaminée avec une petite pelle spécialement conçue, puis à mélanger la même phase fixe avec la phase mobile que le remplissage de la colonne pour former une pâte, puis à compléter soigneusement la phase fixe en pâte dans la partie creusée.(Essayez de rendre la phase de fixation remplie après proche de l'original) etNiveler la surface d'extrémité est correct. Si l'ouverture de la plaque d'écran aux deux extrémités de la tête de colonne est cohérente, la colonne peut être inversée pour utiliser le temps général, dans le but de restaurer l'étanchéité du lit de colonne à l'aide de l'action de rinçage de la phase mobile.

3,Réparation de l'effondrement de la colonne

Les causes de l'effondrement de la colonne sont nombreuses. Pour l'effondrement n'est pas trop grave, si l'ouverture de la plaque d'écran aux deux extrémités de la tête de colonne est cohérente, peut utiliser la colonne à l'envers pendant un temps général, vous pouvez restaurer les performances. Lorsque l'effondrement est grave(5 mm)左右) etLorsque, il peut être réparé par des méthodes de réparation de la contamination de la colonne.