Kit de détection de l'activité pyruvate déshydrogénase (PDH) micromethod

Pyruvate déshydrogénase (PDH) Instructions pour kits de détection d'activité Méthode des traces

Remarque: les réactifs de ce produit ont changé, veuillez noter et suivre strictement cette instruction.

Numéro de fret:BC0385

Spécifications:100T/96S

Composition du produit: Veuillez vérifier soigneusement si le volume de réactif correspond au volume contenu dans la bouteille avant utilisation, en cas de doute, veuillez contacter le personnel de solebao à temps.

Kit de détection de l'activité pyruvate déshydrogénase (PDH) micromethod

Kit de détection de l'activité pyruvate déshydrogénase (PDH) micromethod

Formulation de la solution:

1. Réactif deuxPour:Pour les réactifs volatils, scellés dès que possible après utilisation,-20℃Préserver.

2. Formulation du liquide de travail: poignée avant utilisation5,75 mlRéactif quatre, réactif cinq,0,45 mlRéactif 6,1,75 mlRéactif sept transfert à un flacon de réactif trois mélanger pour dissoudre(au total15.45mL, environ85T) et; avec des réactifs incomplets-20℃Sous - assemblé pour sauver, peut sauver4Semaine.Évitez le gel - dégel répété.

Description du produit:

PDH(EC 4.1.1.1), largement présent dans les animaux, les plantes, les micro - organismes et les cellules en culture, est un complexe pyruvate déshydrogénase(PDHC)Enzyme limiteur de vitesse catalysant la Décarboxylation oxydative du pyruvate, catalysant la désassociation du pyruvate, lier la glycolyse et le cycle de l'Acide tricarboxylique.

PDHDéshydrogénation catalytique du pyruvate, réduction simultanée2,6 -Dichlorophénol indigol (2,6-DCPIP), ce qui entraîne605 nmRéduction de l'absorption de la lumière.

acide pyruvique + thiamine pyrophosphate hydroxyéthylthiamine pyrophosphate

Dichlorophénolindophénol (605nm) + Hydroxyéthylthiamine Pyrophosphate Dichlorophénolindophénol réduit

Note: sélection recommandée avant l'expérimentation2 - 3Un échantillon avec de grandes différences attendues a été pré - expérimental. Si les valeurs d'absorption lumineuse de l'échantillon ne sont pas dans la plage de mesure, il est recommandé de diluer ou d'augmenter la taille de l'échantillon pour la détection.

Instruments et fournitures à apporter:

Spectrophotomètre visible/Étalonneur enzymatique, bain - Marie, centrifugeuse de table, pipette réglable, microverre/ 96Plaque de trou, mortier/Homogénateur, glace et eau distillée.

Étapes opérationnelles:

Un,Traitement des échantillons(la taille de l'échantillon à mesurer peut être ajustée de manière appropriée, les proportions spécifiques peuvent être consultées)

1. Organisation: appeler l'ordre0.1gOrganisation, adhérer1 mlRéactif I et10 μLRéactif II, bien broyé avec un homogénateur de bain de glace ou un homogénateur de mortier,4 ℃ 11000gCentrifugation10 minutesEffacer,Rester sur la glaceMesurer.

2. Échantillons de cellules ou de bactéries: recueillir en premier500Millions de cellules ou de bactéries à l'intérieur du tube de centrifugation, après la centrifugation pour éliminer; Adhérer après1mLRéactif I et10 μLRéactif deux, bain de glace ultrasonique broyage des bactéries (puissance200 W, ultrasons3 s, intervalle7 s, temps total5 minutes); Puis11000g，4℃, centrifugation10 minutes，

Retirer sur la glace à mesurer.

3. Sérum (plasma)Et autres échantillons liquides: détection directe.Si la solution est trouble, la centrifugation est suivie d'un nettoyage pour le dosage.

II. Étapes de détermination

1,VisiblePréchauffage du spectrophotomètre ou de l'étalon enzymatique30 minutesCi - dessus, réglez la longueur d'onde à605 nm, l'eau distillée du spectrophotomètre est mise à zéro.

2,Chaque échantillon doit180 μLLiquide de travail,Selon les besoins expérimentauxRetirer une certaine quantité de liquide de travail pour37℃(mammifères) ou25℃(autres espèces)Dans le bain d'eau potBain d'eau10 minutes- Oui.

3,Tube vide: dans une boîte colorimétrique à l'état de traces ou96Ajouter à la plaque de trou180 μLFluide de travail et10 μLEau, mélanger, enregistrer immédiatement605 nmLe lieu10sLe lieuValeur d'absorption de lumièreA1et1min10sValeur d'absorption de lumière aprèsA2, calculéΔAvide= A1 à A2- Oui.Tube vide juste à tester1 - 2Une fois- Oui.

4,Tube de dosage: dans une boîte colorimétrique à l'état de traces ou96Ajouter à la plaque de trou180 μLFluide de travail et10 μLÉchantillon, mélange, enregistrement immédiat605 nmLe lieu10sLe lieuValeur d'absorption de lumièreA3et1min10sValeur d'absorption de lumière aprèsA4, calculéΔADétermination= A3-A4- Oui.

Trois,PDHCalcul d'activité

a.La formule de calcul déterminée à l'aide d'une boîte micrométrique est la suivante:

1. Calculé par concentration protéique de l'échantillon

Définition des unités: parmgProtéines tissulaires consommées par minute dans le système réactionnel1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité (U/mg prot) et=[(ΔA)Détermination-ΔAvide) ÷(ε × d) et× VAnti - Total× 10⁹]÷(Cpr×VL'échantillon÷T

= 904,762×(ΔA)Détermination-ΔAvide÷Cpr

2. Calculé par qualité d'échantillon

Définition des unités: pargTissu consommé par minute dans le système réactionnel1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité (U/gQualité)=[(ΔA)Détermination-ΔAvide) ÷(ε × d) et× VAnti - Total× 10⁹]÷(V)L'échantillon÷VTotal des échantillons× W) ÷T

= 913,81×(ΔA)Détermination-ΔAvide÷W

3. Calculé par nombre de bactéries ou de cellules

Définition des unités: par1Dix mille bactéries ou cellules consommées par minute dans le système réactif1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité (U/10⁴cellule) et=[(ΔA)Détermination-ΔAvide×VAnti - Total÷(ε × d) et× 10⁹]÷(V)L'échantillon÷VTotal des échantillons× 500)÷T

= 1,828×(ΔA)Détermination-ΔAvide) et

4. Calculé par volume d'échantillon

Définition des unités: parmLliquideDans le système réactionnelConsommation par minute1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité(U/mL) et=[(ΔA)Détermination-ΔAvide×VAnti - Total÷(ε×d)×10⁹]÷VL'échantillon÷T

= 904,762×(ΔA)Détermination-ΔAvide) et

VAnti - Total: volume total du système réactionnel,1,9 × 10^-4L;εPour:2,6 -Le coefficient d'extinction molaire du dichloroindole phénol,2,1 × 10⁴L/mol/cm;d: diamètre optique de la cuve colorimétrique,1 cm;VÉchantillon: ajouter le volume de l'échantillon,0,01 ml;VTotal de l'échantillon: ajout du réactif I et du réactif II en volume,1,01 ml;T: temps de réaction,1 minute;CPR: concentration protéique de l'échantillon,mg/mL;W: qualité de l'échantillon,g;500: nombre total de bactéries ou de cellules,500Million.

b.Utiliser96La formule de calcul pour la détermination de la plaque à trous est la suivante:

1.Calculé par concentration protéique de l'échantillon

Définition des unités: parmgProtéines tissulaires consommées par minute dans le système réactionnel1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité (U/mg prot) et=[(ΔA)Détermination-ΔAvide×VAnti - Total÷(ε × d) et× 10⁹]÷(Cpr×VL'échantillon÷T

= 1809,524×(ΔA)Détermination-ΔAvide÷Cpr

2.Calculé par qualité d'échantillon

Définition des unités: pargTissu consommé par minute dans le système réactionnel1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité (U/gQualité)=[(ΔA)Détermination-ΔAvide×VAnti - Total÷(ε × d) et× 10⁹]÷(V)L'échantillon÷VTotal des échantillons× W) ÷T

= 1827,62×(ΔA)Détermination-ΔAvide÷W

3.Calculé par nombre de bactéries ou de cellules

Définition des unités: par1Dix mille bactéries ou cellules consommées par minute dans le système réactif1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité (U/10⁴cellule) et=[(ΔA)Détermination-ΔAvide×VAnti - Total÷(ε × d) et× 10⁹]÷(V)L'échantillon÷VTotal des échantillons× 500) ÷T

= 3,655×(ΔA)Détermination-ΔAvide) et

4.Calculé par volume d'échantillon

Définition des unités: parmLliquideDans le système réactionnelConsommation par minute1 nmol 2,6-Dichlorophénol l'indigol est défini comme une unité d'activité enzymatique.

PDHActivité(U/mL) et=[(ΔA)Détermination-ΔAvide×VAnti - Total÷(ε×d)×10⁹]÷VL'échantillon÷T

= 1809,524×(ΔA)Détermination-ΔAvide) et

VAnti - Total: volume total du système réactionnel,1,9 × 10^-4L;εPour:2,6 -Le coefficient d'extinction molaire du dichloroindole phénol,2,1 × 10⁴L/mol/cm;dPour:96Diamètre optique de la plaque de trou,0,5 cm;VÉchantillon: ajouter le volume de l'échantillon,0,01 ml;VTotal de l'échantillon: ajout du réactif I et du réactif II en volume,1,01 ml;T: temps de réaction,1 minute;CPR: concentration protéique de l'échantillon,mg/mL;W: qualité de l'échantillon,g;500: nombre total de bactéries ou de cellules,500Million.

Précautions:

1,Tous les échantillons sont placés sur la glace pendant la détermination et2Détection dans les heures afin de ne pas dénaturer et inactiver.

2,Détermination du tubeΔALa valeur est dans0,01 - 0,25Entre, si le tube est déterminéΔAValeur supérieure à0.25L'échantillon doit être dilué.Multipliez le multiple de dilution dans la formule de calcul.Si le tube est déterminéΔAValeurPetitÀ0.01Il est nécessaire d'augmenter la taille de l'échantillon après le réexamen, en prenant soin de modifier la formule de calcul de manière synchrone.

3,En raison de la présence d'une certaine concentration de protéines dans le réactif I (environ1 mg/mL), il faut donc soustraire lors de la détermination de la concentration protéique de l'échantillonRéactif unLa teneur en protéines.

Exemples expérimentaux:

1,取0.1gFoie de sourisAdhérer1 mlRéactif I et10 μLRéactif II, bien broyé avec un homogénateur de bain de glace ou un homogénateur de mortier,4℃Et,11000gCentrifugation10 minutes, prenez la glace de dégagement, suivez les étapes de détermination, utilisezBoîte colorimétrique à traces de quartzMesurécalculΔADétermination=A3-A4=1.3106-1.1183=0.1923,ΔAvide=A1-A2 =1.3325-1.3314=0.0011, en fonction de la masse de l'échantillon, l'enzyme vit:

PDHActivité(U/g)qualité= 913,81×(ΔA)Détermination-ΔAvide÷W=1747 U/gQualité.

Littérature publiée pertinente:

[1]Peng S, Wang Y, Zhou Y, et al. Les ginsénosides rares améliorent la résistance à l'insuline myocardienne induite par la surcharge lipidique en modulant la flexibilité métabolique [J]. Phytomédecine, 2019, 58: 152745.

Références:

[1]Guitart M, Andreu A L, García-Arumi E, et al. FATP1 se localise dans les mitochondries et améliore l'activité de la pyruvate déshydrogénase dans les myotubes squelettiques [J]. Mitochondrion, 2009, 9(4): 266-272.

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