Kit souris Interleukine - 1aelisa

Kit souris Interleukine - 1aelisa

Introduction au contexte:

Il - 1 est disponible sous deux formes moléculaires différentes, une il - 1α, composée de 159 acides aminés; L'autre, appelé il - 1β, contient 153 acides aminés; Les deux sont codés séparément par des gènes différents. Les gènes de l'il - 1 humaine et Murine sont localisés sur le Chromosome 2 et contiennent chacun 7 Exons. Le précurseur de l'il - 1 (proil - 1) est de 31 kDa et forme une molécule d'il - 1 mature par lyse enzymatique protéolytique. Il - 1 a une homologie plus élevée dans différents genres. Au niveau des acides aminés, l'il - 1α et l'il - 1β sont respectivement de 60 à 70% et de 75 à 78% d'homologie dans différents genres; Mais il - 1α est seulement 25% homologue avec il - 1β dans le même genre. L'il - 1α et l'il - 1β ont un poids moléculaire d'environ 17,5 kDa, des points isoélectriques de 5 et 7 respectivement et une homologie de 28%, l'il - 1α et l'il - 1β se liant à la même affinité.Surface des cellulesLes récepteurs, qui jouent le même rôle biologique.

Principe de détectionPour:

Solarbio (Solarbio ®)Les kits ELISA utilisent une technologie de détection immunoadsorbante enzymatique basée sur la méthode sandwich à double anticorps. L'anticorps monoclonal anti - il - 1a de souris est encapsulé sur une plaque enzymatique; Ajouter Gradient dilué étalon et échantillon pré - dilué, respectivement, étalon et échantillon dans lequel l'il - 1a de souris sera bien lié à l'enzyme sur la plaque de marquage par l'anticorps; Après lavage de la plaque, on ajoute un anticorps anti - il - 1a de souris biotinylé qui se lie spécifiquement à l'il - 1a de souris dans les étalons encapsulés dans l'anticorps sur la plaque et dans l'échantillon; Ajout de Streptavidine marquée à la peroxydase de raifort (HRP) après lavage de la plaque, une liaison non covalente de haute intensité de la biotine à la streptavidine se produit; Après le lavage de la plaque, ajouter le substrat chromogène TMB, si différentes concentrations d'il - 1a de souris sont présentes dans l'échantillon dans les puits réactionnels, HRP transformera le TMB incolore en une substance bleue de différentes profondeurs (corrélation positive), après l'ajout du liquide de terminaison, les puits réactionnels deviendront jaunes; Après cela, à λ max = 450 L'Absorbance (do) de l'échantillon de puits réactionnels a été déterminée à nm (do = 450 nm) et la concentration d'il - 1a de souris dans l'échantillon était directement proportionnelle à la do. La concentration d'il - 1a de souris dans l'échantillon a été calculée en traçant une courbe standard et un logiciel d'ajustement à quatre paramètres.

Schéma de principe:

Précautions:※※※

• Le kit doit être utilisé pendant la période de validité, veuillez ne pas utiliser de réactifs périmés.
• Le kit doit être conservé au réfrigérateur à 2 - 8 ° C lorsqu'il n'est pas utilisé, les normes qui ont été remises en solution mais qui ne sont pas utilisées, veuillez les jeter.
• Veuillez récupérer le kit à température ambiante avant utilisation 30 min， Et bien mélanger les différents composants de la cartouche de réactif et les échantillons préparés.
• Dans l'essai, les étalons et les échantillons sont recommandés pour la détection des pores et l'ordre dans lequel les réactifs sont ajoutés doit être maintenu *.
• Pour éviter la contamination croisée, veuillez utiliser le tube à essai sexuel 1 fois dans l'essai, tête de pistolet, film de scellement (※), et des contenants en plastique propres. .
• Moins de volume d'anticorps biotinylés concentrés et de conjugués enzymatiques concentrés, des traces de liquide peuvent s'infiltrer dans la paroi du tube et la bouteille pendant le transport

Sur le couvercle, avant l'utilisation, s'il vous plaît centrifuger le traitement (5 - 10 s est OK), de sorte que le liquide sur la paroi du tube se concentre sur le fond du tube, lors de l'utilisation, s'il vous plaît souffler soigneusement plusieurs fois avec une pipette.

• Sauf que le liquide de lavage concentré et le liquide de terminaison contenus dans le kit peuvent être génériques, n'utilisez pas les tests inclus dans les kits provenant d'autres sources

Les agents remplacent un composant unique dans ce kit.

• Pour garantir des résultats précis, une courbe standard est requise pour chaque détection.

Conseils de sécurité:Le liquide de terminaison dans le kit est une solution acide, les opérateurs doivent apporter des gants et prêter attention à la protection lors de l'utilisation; Évitez également le contact du réactif avec la peau et les yeux Pendant l'opération, en cas de contact accidentel, lavez - le abondamment à l'eau claire; Lors de l'analyse d'échantillons de sang et d'autres liquides corporels, veuillez respecter les règles de sécurité et de protection des laboratoires biologiques nationaux.

Composition et stockage des kitsPour:

Équipement expérimental autonome (non disponible, disponible en remplacement)

• étalonneur enzymatique (longueur d'onde principale 450 nm, longueur d'onde de référence 630 nm)
• Pipette de haute précision et tête d'aspiration jetable: 0,5 - 10,2 - 20,20 - 200200 - 1000μl
• Machine à laver les plaques ou à laver les bouteilles
• 37℃Boîte d'incubation
• Double vapeur d'eau, eau désionisée, cylindre de mesure, etc.
• Tubes à essai en polypropylène pour dilution

Collecte et stockage des échantillons:

• Culture cellulaire supérieure:

Le milieu cellulaire a été décanté dans un tube de centrifugation stérile, centrifugé à 1000 × G à 4 ° C pendant 10 min, puis des portions égales de surnageant ont été placées dans de petits tubes EP et conservées à - 20 ° C (détection en 24 heures peut être placé dans 2 - 8 ° C stockage), En évitant la congélation et la dégel répétées.

• échantillons de sérum:

Après 20 min de coagulation naturelle du sang à température ambiante, centrifuger à 1000 × g pendant 10 min à 4 ℃, puis charger des portions égales de surnageant dans de petits tubes EP et conserver à - 20 ℃ (détection dans les 24 heures peut être mis dans 2 - 8 ℃ stockage), si le processus de conservation est précipité, s'il vous plaît centrifuger à nouveau, éviter la congélation et la dégel répétées.

• échantillons de plasma:

Le sang total est recueilli dans des tubes contenant un anticoagulant, l'EDTA est sélectionné en fonction des besoins réels du spécimen, du citrate de sodium ou de l'héparine comme anticoagulant, mélangé pendant 20 min, centrifugé à 1000 × G à 4 ° C pendant 10 min, puis des portions égales de surnageant sont placées dans de petits Tubes EP et conservées à - 20 ° C (le test en 24 heures peut être placé à 2 - 8 ° C pour le stockage), en évitant la congélation et la dégel répétées.

※Attention:Les échantillons de plasma sérique évitent l'utilisation d'échantillons hémolytiques et hyperlipidiques afin de ne pas affecter les résultats des tests; Si la concentration de détection de la cible dans l'échantillon est supérieure à la valeur élevée de la norme, faites un test après Dilution Multiple approprié de l'échantillon, il est recommandé de faire une pré - expérience avant l'expérience formelle pour déterminer le multiple de dilution.

Préparation des réactifsPour:

• Retour à la température du réactif: Tout d'abord 30 min avant l'expérience, l'échantillon à tester est placé à la température ambiante, le liquide de lavage concentré s'il y a cristallisation, veuillez mettre dans un bain chaud de 37 ℃ jusqu'à ce que la cristallisation soit entièrement dissoute.
• Formulation du liquide de lavage: le volume d'utilisation du liquide de lavage après une bonne dilution est calculé à l'avance, puis le liquide de lavage concentré 20x est dilué dans une solution d'application 1x avec de l'eau bi - vapeur ou désionisée, le liquide de lavage concentré non utilisé est placé dans un réfrigérateur à 4 ° c pour le conserver.

3. Gradient de dilution de l'étalon: ajouter à l'étalon / échantillon diluant (Sr1) 1 mL d'étalon lyophilisé, laisser reposer 15 minutes pour le * dissoudre et mélanger doucement (concentration de 2000 pg / ML), puis diluer selon les concentrations suivantes: 2000, 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25, 0 pg / ML. Le liquide brut de produit standard reconditionné (2000 pg / ML) qui n'est pas utilisé doit être abandonné ou divisé selon une dose unique au besoin et stocké au réfrigérateur à - 20 ~ - 80 ° C, comme indiqué ci - dessous.

Liquide de travail d'anticorps biotinylé: pré - Calculez la quantité nécessaire pour un bon test, diluez le concentré d'anticorps 100X dans le liquide de travail d'application 1x avec la dilution de détection (Sr2) (bien mélanger avant la dilution), veuillez ajouter dans les puits de réaction dans les 30 minutes.

Liquide de travail anticorps biotinylé spécifiqueMéthode de dilutionComme suit:

5. Liquide de travail de conjugué enzymatique: formulé dans la quantité requise pour chaque essai, diluer 100 fois concentré de conjugué enzymatique avec la dilution de conjugué enzymatique (Sr3) dans 1x liquide de travail d'application (centrifuger avant dilution), s'il vous plaît utiliser dans les 30 minutes.

Liquide de travail spécifique de conjugué enzymatiqueMéthode de dilutionComme suit:

6. Méthode de lavage:

• Lavage automatique de la plaque: vider le liquide dans les puits de la plaque de référence enzymatique, sécher sur du papier épais à eau perméable, injecter le liquide de lavage est de 300 µl / puits, l'intervalle entre l'injection et l'aspiration est de 30 secondes, laver la plaque 5 fois.
• Laver la plaque à la main: jeter le liquide dans les trous de la plaque de marquage enzymatique, sécher sur du papier absorbant épais, ajouter le liquide de lavage 300ul / puits avec un flacon de lavage, après 30 secondes de repos, vider le liquide dans les trous de la plaque de marquage enzymatique, sécher sur du papier absorbant épais, laver la plaque 5 fois.

Étapes de détection:

Jugement des résultatsPour:

1. Détermination de la valeur od avec un étalon enzymatique à une longueur d'onde de 450 nm. Sélectionnez détection à deux longueurs d'onde avec une longueur d'onde de référence de 630 nm. Si vous ne pouvez pas effectuer de détection à deux longueurs d'onde, soustrayez la valeur de la détermination de la do de 630 nm à la valeur de la détermination de la do de 450 nm.

2. Calculer la valeur od moyenne des étalons, échantillons: la valeur od de chaque étalon et échantillon doit être diminuée de la valeur od du trou zéro

3. Avec la concentration du produit standard en abscisse et la valeur de l'Absorbance od en ordonnée, la courbe standard est tracée avec le logiciel, la teneur en il - 1a de l'échantillon peut être convertie par la courbe standard par la valeur de l'od correspondante.

Si la valeur od du spécimen est supérieure à la limite supérieure de la courbe standard, il faut procéder à une nouvelle détection après dilution appropriée, puis multiplier la concentration par un multiple de dilution.

Caractérisation des paramètresPour:

1. Données et courbes standard

Cette figure est à titre indicatif seulement et le contenu de l'échantillon d'il - 1a de souris doit être calculé à partir de la courbe standard tracée par les étalons d'essai.

2. Sensibilité:

Faible concentration d'il - 1a détectable chez la souris jusqu'à 15 pg / ML,

La moyenne de 20 concentrations de standard zéro OD, plus deux écarts - types, calcule les concentrations détectables correspondantes.

3. Spécificité:

Ne réagit pas avec l'il - 1 de souris, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 10, 12, 13, il - 1 de ratbêtaRéactions égales

4. Répétabilité:

Intraplaque, coefficient de variation interplaque < 10%

5. Taux de recyclage:

Les taux de récupération ont été calculés en ajoutant 3 niveaux de concentration différents d'il - 1a de souris dans le plasma de souris saines sélectionnées, surnageant des cultures cellulaires.

6. Dilution linéairePour:

Des concentrations élevées d'il - 1a Murine ont été ajoutées à 4 portions sélectionnées de plasma de souris saines et de surnageants de culture cellulaire, respectivement, diluées dans la plage cinétique de la courbe standard, la linéarité étant évaluée.

RéférencesPour:

1. Greenfeder, S.A. et al. (1995) J. Biol. Chem.270: 13 575.

2. Wesche, H. et al. (1997) J. Biol. Chem.272: 7 727.

3. Sims, J.E. et al. (1994) Clin. Immunol. Immunopathol.72: 9.

4. Sims, J.E. et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA90: 6 155.

5. Colotta, F. et A. Mantovani (1994), Tendances pharmacologiques. Sci.14: 138.

6. Svenson, M. et al. (1993) Cytokine5: 427.

7. Giri, J. G. et al. (1994) J. Immunol.153: 5 802.

Questions fréquemment posées et solutionsPour:

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