Service expérimental d'électrophorèse bidirectionnelle des protéines

Un,Service expérimental d'électrophorèse bidirectionnelle des protéinesIntroduction aux techniques expérimentales

2D - WB est une technique d'électrophorèse bidirectionnelle combinée à un Blot traditionnel de l'Ouest. Le processus expérimental général est que le mélange de protéines antigéniques est d'abord séparé par électrophorèse bidirectionnelle, puis la protéine gélifiée est transférée sur la membrane de support, puis la couleur est révélée par hybridation d'anticorps. La technologie 2D - WB, qui peut détecter de minuscules changements dans le point isoélectrique de l'antigène ou dans le poids moléculaire, a une bonne application dans l'étude des modifications post - traductionnelles des protéines; Alors que 2D - WB, en combinaison avec la technologie d'identification par spectrométrie de masse, peut trouver des antigènes plus immunogènes à partir de mélanges de protéines.

Deux,Service expérimental d'électrophorèse bidirectionnelle des protéinesAperçu

2D - WB est une technique d'électrophorèse bidirectionnelle combinée à un Blot traditionnel de l'Ouest. Le processus expérimental général est que le mélange de protéines antigéniques est d'abord séparé par électrophorèse bidirectionnelle, puis la protéine gélifiée est transférée sur la membrane de support, puis la couleur est révélée par hybridation d'anticorps. La technologie 2D - WB, qui peut détecter de minuscules changements dans le point isoélectrique de l'antigène ou dans le poids moléculaire, a une bonne application dans l'étude des modifications post - traductionnelles des protéines; Alors que 2D - WB, en combinaison avec la technologie d'identification par spectrométrie de masse, peut trouver des antigènes plus immunogènes à partir de mélanges de protéines.

Iii. Contenu du Service

Extraction et quantification des protéines;

2, électrophorèse bidirectionnelle;

3, Transmembrane, fermé, incubé, montrant l'imagerie.

Iv. Processus opérationnel expérimental

Electrophorèse (IEF), équilibrage de bande de colle, deuxième électrophorèse SDS - apge.

2, après la fin de la deuxième électrophorèse, retirez le gel pour transmembranage, la méthode de transmembranage peut choisir le transfert par voie humide et le transfert par voie semi - sèche. Les membranes couramment utilisées sont les membranes NC et PVDF.

3, fermé, 5% poudre de lait écrémé ou 5% BSA fermé pendant 1 heure (température ambiante) ou toute la nuit (4 degrés).

4, un anti - incubation, sélectionnez le temps d'incubation selon la description de l'anticorps, les conditions d'incubation conventionnelles sont la température ambiante pendant 1 heure ou 4 degrés pendant la nuit, un anti - incubation après l'enlèvement de la membrane

Le tbst est lavé 3 fois pendant 5 minutes chacune.

5, incubation anti - deux: Sélectionnez un anti - deux approprié (anti - souris, anti - humain, anti - lapin, etc.) en fonction de l'anti - un, retirez la membrane tbst après 1 heure d'incubation à température ambiante et lavez - la 3 fois pendant 5 minutes chacune.

6, développement: diluer le substrat a, B dans des proportions égales après la table de mélange goutte à goutte sur la membrane, la chambre noire placez le film sur la membrane, le couvercle du clip de compression, après un certain temps d'exposition placez le film dans le liquide de développement pour le développement jusqu'à ce qu'Une bande claire de protéines apparaisse, rinçage à l'eau claire après la fixation dans le liquide de fixation, le temps d'exposition doit tenir compte de la quantité supérieure de protéines, la concentration de dilution d'anticorps, le temps d'incubation d'anticorps et d'autres facteurs.

7, après la fixation, nettoyez le film, laissez sécher, étalonnez le marqueur, numérisez l'image et l'analyse d'image 2D Western Blot.

Afin de garantir le bon déroulement du Service technique 2D Western Blot, l'envoi des échantillons doit répondre aux exigences suivantes:

1, les clients fournissent: tissu, cellule, solution de protéine, etc.; Une résistance (peut être vendue en remplacement par Research and Young Corporation).

2, conditions de transport: paquet de glace sèche ou d'azote liquide envoyé.

Remarque: les échantillons doivent être protégés contre tous les types de contamination et de congélation et dégel répétés.

V. contenu du rapport sur les services techniques

Résultats quantitatifs de protéines et quantités d'échantillon sur l'électrophorèse;

2. Film original, images électroniques et résultats d'analyse d'image;

3, 2d Western Blot rapport d'expérience complet, y compris les étapes expérimentales, l'utilisation d'instruments et de réactifs, etc.

Inclus: Étapes expérimentales du Blot Western 2D

1, 2d Western Blot préparation d'échantillons de protéines, le principe principal de la préparation est de dissoudre autant que possible toutes les protéines, perturber l'interaction entre les protéines et les protéines, éviter toutes sortes de substances perturbatrices, la préparation d'échantillons est compatible avec IEF, etc.

2, les principales étapes de l'électrophorèse bidirectionnelle, l'électrophorèse item (IEF), l'équilibre de la bande de colle, la deuxième électrophorèse item SDS - apge.

3, après la fin de la deuxième électrophorèse, retirez le gel pour transmembranage, la méthode de transmembranage peut choisir le transfert par voie humide et le transfert par voie semi - sèche. Les membranes couramment utilisées sont les membranes NC et PVDF.

4, fermé, 5% poudre de lait écrémé ou 5% BSA fermé pendant 1 heure (température ambiante) ou toute la nuit (4 degrés).

5, - anti - incubation, le temps d'incubation est choisi en fonction de la description de l'anticorps, les conditions d'incubation classiques sont la température ambiante pendant 1 heure ou 4 degrés pendant la nuit, un anti - incubation est suivie par le retrait de la membrane tbst lavé 3 fois pendant 5 minutes chacune.

6, incubation de l'anti - deux: Selon l'anti - choisir un anti - deux approprié (anti - souris, anti - lapin humain, etc.), après 1 heure d'incubation à température ambiante, retirer la membrane tbst lavé 3 fois pendant 5 minutes chacune.

7, développement: diluer le substrat a, B en proportion après mélange uniforme goutte à goutte sur la membrane, chambre noire placez le film sur la membrane, couvrir le clip de compression, après un certain temps d'exposition placez le film dans le liquide de développement pour le développement, jusqu'à ce qu'il apparaisse une bande de protéines claires, rinçage à l'eau claire après la fixation dans le liquide de fixation, le temps d'exposition doit être pris en compte dans l'ensemble des protéines. La quantité d'échantillon supérieure, la concentration de dilution d'anticorps, le temps d'incubation d'anticorps et d'autres facteurs.

8, après fixations, nettoyez le film, laissez sécher, étalonnez le marqueur, numérisez l'image et l'analyse d'image 2D Western Blot.

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