Kit de préparation de cellules sensitives haute efficacité

Kit de préparation de cellules sensitives haute efficacité

Numéro de catalogue:30018

Composition du kit, stockage, stabilité:

Utilisez 4 ° C à court terme pour éviter la contamination. Conservation à long terme - 20 ℃ efficace pendant un an.

Les paramètres du produit spécifique sont soumis aux paramètres de la description du produit reçu

Introduction du produit:

1. Kit de préparation de cellules sensitives haute efficacitéIl est basé sur la méthode traditionnelle de préparation de cellules sensibles à haute efficacité pour apporter des améliorations appropriées, une opération facile et une efficacité de conversion élevée.

2. L'efficacité de l'état sensoriel peut atteindre 10 avec ce kit⁸CFU / µg de plasmide. L'efficacité est légèrement supérieure pour les petits plasmides et légèrement inférieure pour les plus gros. Les cellules hautement réceptrices préparées avec ce kit permettent non seulement de transformer les plasmides, mais sont également parfaitement adaptées à la transformation de produits de ligation courants, particulièrement adaptés aux situations où une efficacité de transformation élevée est requise pour la transformation de ligatures Plates, etc.

3. L'utilisation de ce kit est simple et la préparation des cellules sensibles à haute efficacité ne prend qu'environ 60 minutes après la culture bactérienne.

4. Ce kit convient à la grande majorité des bactéries E. coli courantes, notamment Top 10, dh5α, BL21 (DE3), jm109, tg1, HB101 et XL - 1, entre autres. Mais l'efficacité de conversion peut varier considérablement d'une souche à l'autre.

5. Ce kit peut être utilisé en plusieurs fois pour préparer un total de 100 cellules réceptrices de 100 µl.

v Précautions:

1. Tous les réactifs, consommables, instruments et équipements doivent être stérilisés.

2. La LB sans antibiotiques est utilisée lors de la préparation des cellules réceptrices. La LB sans antibiotiques doit également être utilisée lors de la culture à 37 ° c Après un choc thermique lors de l'utilisation de bactéries réceptrices, même si le plasmide transféré est résistant.

3. Cellules réceptrices prêtes, veuillez passer rapidement à - 70 ° c.

Étapes de fonctionnement: (Lisez les précautions avant d'expérimenter)

1. Appliquer la plaque:

Pour une efficacité sensorielle optimale, les glycérobactéries ou d'autres souches conservées doivent d'abord être enduites de plaques LB et cultivées pendant la nuit.

2. Inoculation:

Prenez une plaque LB avec des souches fraîchement cultivées et les opérations ultérieures sont toutes effectuées dans une table ultra - propre. Trempez l'extrémité de la pince dans de l'alcool à 70% et faites - la légèrement griller sur une lampe à alcool pour que l'extrémité de la pince soit stérile. Prenez une tête de pistolet en plastique stérile ou un cure - dents avec une pince à brucelles, sélectionnez un monoclone de la plaque et placez la tête de pistolet en plastique ou le cure - dents imbibé de la souche dans un tube de culture bactérienne contenant 3 ml de Sob ou LB (le client doit choisir le milieu approprié en fonction de la souche). Les opérations ci - dessus peuvent également être effectuées à l'aide d'anneaux d'inoculation, etc.

3. Cultiver:

37 ℃ environ 250rpm incubation pendant la nuit, généralement le temps de culture contrôlée autour de 16 heures est approprié. Il ne faut jamais dépasser 18 heures.

4. Culture de revaccination:

Les cultures sont ensemencées avec des bactéries fraîchement cultivées pendant la nuit dans un rapport de 1: 500 en fonction de la quantité de cellules hautement sensibles que l'on souhaite préparer. Par exemple, prendre 100 microlitres de bactéries fraîches pendant la nuit dans 50 ml de Sob ou LB, 37 ° C environ 250 RPM pour la culture.

5. Préparation des cellules réceptrices sensorielles:

ð Remarque: la vitesse de rotation de la centrifugeuse et le temps de centrifugation sont très importants pour la production de cellules sensibles, la vitesse de rotation optimale et le temps de centrifugation diffèrent pour différents types de bactéries et doivent être optimisés au cas par cas. L'état optimal est la vitesse de rotation appropriée et le temps de centrifugation pour que les bactéries soient juste centrifugées pour précipiter, sans être trop serrées, sinon la remise en suspension est difficile, vous ne pouvez la remettre en suspension qu'en soufflant fort, ce qui causera des dommages aux cellules et affectera l'efficacité de la conversion.

1) Lorsque la bactérie en culture od600 atteint environ 0,5, le liquide bactérien en culture est placé dans un bain de glace et refroidi pendant 15 minutes. Remarque: toutes les opérations ultérieures doivent être effectuées à 4 degrés ou dans un bain de glace.

2) 4 ℃ (centrifugeuse doit être refroidie à l'avance) 3000 - 3500g centrifuger pendant 5 minutes pour recueillir les bactéries, défausser le déblaiement (essayez d'éliminer le déblaiement propre, moins il reste, mieux c'est).

3) Si la quantité de bactéries avant la précipitation par centrifugation est de 50 ml, on procède comme suit, si c'est un autre volume, après conversion proportionnelle.

4) Préparer la solution a avec 10 ml de pré - refroidi à l'état hautement sensible pour suspendre doucement le précipité bactérien (pour faciliter la remise en suspension, vous pouvez ajouter une petite quantité de solution a, remettre en suspension avant d'ajouter le reste de la solution a), souffler la suspension doit être doux, sinon cela affectera L'effet.

5) Bain de glace pendant 15 minutes.

6) 4 ℃ (la centrifugeuse doit être refroidie au préalable) 3000 - 3500 G centrifuger pendant 5 - 7 minutes pour recueillir les bactéries et les éliminer.

7) Préparer la solution B avec 2 ml de l'état hautement sensible pré - refroidi en suspendant doucement le précipité bactérien. Assurez - vous d'être doux lorsque vous Soufflez sur le porte - à - faux, sinon cela affectera l'effet.

8) Bain de glace pendant 15 minutes.

9) Le fractionnement est effectué sur le bain de glace et peut être correctement fractionné en 50 - 200 microlitres / tube selon les besoins.

10) Utilisation immédiate ou conservation à - 70 ° c Après congélation rapide avec un bain de glace carbonique à l'azote liquide ou à l'éthanol.