Kit de clonage simple TOPO-TA/Blunt Lightning

NoboladeKit de clonage simple TOPO-TA/Blunt Lightning

Kit de clonage simple TOPO-TA Blunt Lightning

Numéro de cataloguePour:42212

Contenu du produit:

Conditions de conservation:

-20℃, stockage12 Mois, n'affecte pas l'efficacité de l'utilisation.

Introduction au produit:

Le clone ta ou le clone Blunt peut être complété en 20 minutes à température ambiante, avec un taux de positivité proche de 100%, et un bain de glace, une stimulation thermique, un criblage sans taches blanches bleues, ainsi que la fixation de fragments d'ADN jusqu'à 10 KB.

Étapes de clonage(≤ fragments de 3 KB)Pour:

Simplifier les étapes(≤10kb) Fragments) et Sans réanimation, sans liquide LB

1, connexion: température ambiante 5 horloges;

1, connexion: 37℃ connexion 5 min- Oui.

2, transformation: chambreLa température 5 L'horloge;

2, transformation: bain de glace 5 min， 42℃ chaleur 1 min， Sur la glace 2 min- Oui.

3, réanimation: 180rpm, 37℃ culture oscillante10 Minutes; Revêtement de plaques.

3, prenez toute la plaque de revêtement de liquide bactérien, 37 ℃ culture inversée.

Étapes opérationnelles:

1. la PCRPréparation du produit:

a. Exigences relatives aux amorces: les amorces ne peuvent pas être phosphorylées.

b. Sélection des enzymes: sélection au besoinADN Polymérase, ce vecteur est compatiblela PCR Du produitA Fin et fin de paix.

c. Détection électrophorétiqueQuantité et qualité des produits PCR:

① seulement la bande de destination, peut directement effectuer la réaction de liaison, pas besoin de purification;

② s'il y a plusieurs bandes, il est recommandé que le gel récupère le fragment d'ADN (dc011 - 100);

③ si l'amplification est modélisée avec un plasmide, la récupération du gel doit être effectuée car le plasmide modélisé développe également des colonies non intentionnelles.

2. Réaction de connexion:

1) La température ambiante (20℃ - 37℃) établit le système de connexion (10µl) Le système):

Quantité recommandée de fragments insérés de différentes tailles:

Après avoir ajouté les réactifs, mélanger légèrement le fond du tube (ou mélanger doucement par soufflage)) etPoint de centrifugation recueillir tous les liquides au fond du tube de centrifugation.

2) Température ambiante (20℃ - 37℃)Connexion5 Minutes. Les produits de ligation peuvent transformer directement les cellules réceptrices ou être placés sur la glace en réserve.

3. Transformation, réanimation, revêtement:

1）100ul Cellules sensibles, placées à température ambiante pour décongeler (Environ1 Pendant environ quelques minutes), épousseter légèrement plusieurs fois pour mettre les cellules en suspension uniformément.

2) Adhérer10ul de liquide de connexion, mélanger doucement, température ambiante (20 ℃ - 37 ℃)Placement5 minutes.

3) Adhérer500uléquilibré à température ambianteLBOuSOC Milieu de culture (sans antibiotiques), 37℃180 rpmCulture oscillatoire10 min- Oui.

（Remarque: plus grand que3 Ko Fragments, temps de culture oscillatoire prolongé à 30 - 60 Minutes, il est possible d'augmenter les transformants. Ou avec des étapes simplifiées) et

4) 取200l Plaque de revêtement liquide bactérien (Contient de l'ampicilline Qing mycine50-100ug/ml）， Cultiver pendant la nuit. (pour obtenir plus de clones, 4000 rpm Centrifugation1 min， Aspirer la partie nettoyée, réserver100-150ul， Agiter légèrement les bactéries en suspension, prendre toute la plaque de revêtement de liquide bactérien)

Remarque: Si vous utilisez5ul Système, chaque ingrédient est réduit de moitié en proportion, le nombre d'utilisations peut être doublé.

4. Identification par criblage des transformants:

Le taux de positivité de ce produit est assez élevé, en général, on peut atteindre ce qu'on voit et ce qu'on obtient, tant que les colonies qui poussent sont normales (non contaminées)Hétérobactéries, le nombre de transformants n'est pas trop faible non plus) etContient essentiellement l'insertion. Ainsi, le fragment inséré ne dépasse pas2-3kb Sans identification dans le casSélection directe1 - 2 bactéries déséquencées.

1) La coloniela PCR Détection: sélectionner une seule colonie à 10ul Eau stérile, mélanger, prendre 1ulPlacé dans25ul la PCR Le système,AvecL'amorce PCR ou l'amorce générique M13 permet d'identifier les clones positifs.

2)Le séquençage des amorces génériques m13f (- 20) / m13r (- 26) a été utilisé pour déterminer si le clone cible était contenu.

Ptopo ta / BluntCarte des vecteurs:

Ptopo ta / Blunt Séquence du vecteur:

Kit de clonage simple TOPO-TA/Blunt Lightning