One Step Seamless cloning Kit clone sans couture

NoboladeOne Step Seamless cloning Kit clone sans couture

Kit de clonage sans couture en une étape (Un seul fragment) et

Numéro de catalogue:42111

Quantité d'emballage:

Stockage des produits:-20°C conserver pour éviter plusieurs gelées et dégel répétés

Les paramètres du produit spécifique sont soumis aux paramètres de la description du produit reçu

Description du produit:Le kit de clonage sans couture en une étape ne dépend pasT4Ligase, qui n'est pas limitée par le vecteur et le site de coupure enzymatique du fragment d'intérêt, tandis que la méthode de recombinaison directe avec des fragments superposés, en utilisant une combinaison enzymatique spéciale peut linéariser toute méthode après le vecteur et avoir ses deux extrémités16-25bpDe la zone de chevauchementla PCRLigature recombinante dirigée par fragment, qui peut30Réalisé en minutesAExtrémité ou bout platla PCRLe fragment de produit est cloné sans couture de manière directionnelle efficace à n'importe quel site du vecteur.

Caractéristiques du produit:

1. 30Les minutes peuvent mettre unePCR de 50bp à 15kbFragment amplifié (plat/ AExtrémité) le clone est inséré n'importe où dans n'importe quel vecteur.

2.Disponibilité des sites de coupure enzymatique des fragments non soumis au vecteur et insérésExtrémité de la paix/粘性末端的限Le clonage peut être effectué à n'importe quel site.

3. Clone sans couture, le point d'insertion n'introduit pas de séquences de bases indésirables.

4. Ne dépend pas de ligase et de phosphatase, haute efficacité, précision, clone positif95%Ci - dessus.

Schéma de principe du kit de clonage sans couture en une étape:

Vecteur linéarisé et insertionADNPréparation des fragments:

A: préparation du support linéarisé

(1).Source de coupure enzymatique:Le vecteur linéaire résultant du clivage enzymatique, les extrémités plates ou visqueuses, le clivage enzymatique simple ou double peuvent être, le clivage enzymatique après récupération de la colle.

Remarque: pas de double brin dans le système de réaction de clonage sans soudure en une étapeADNLigase, la réaction d'auto - ligation du vecteur ne se produit pas. Ainsi, même les supports linéarisés préparés de manière mono - enzymatique ne nécessitent pas de traitement de déphosphatation terminale. Clones faussement positifs apparaissant après transformation du produit recombinant(Aucun fragment inséré) etEst formé par la transformation d'un vecteur cyclique non linéarisé par Quan imparfait enzymatiquement. Nous recommandons que la récupération de colle après découpage enzymatique puisse réduire cette proportion de vecteurs non linéarisés au degré le plus di.

(2).inversela PCRSource:Haute fidélité recommandéeADNPolymérase (numéro de fret:P517-05ouP812-05), préparé si la bande amplifiée seule peut passerla PCRPurification du produit (numéro de produit:DC012-50), le support est obtenu, sinon récupéré par colle (réf. Produit:DC011-50)Obtenir le vecteur.

Note: inverséla PCRLe gabarit plasmidique est également un vecteur non linéarisé et peut également conduire à des clones faussement positifs (sans fragment d'insertion), doncla PCRVecteur linéaire source (la PCRProduit) utilisé avant purificationDpn IEndonucléase digère le modèle de plasmide qui peut réduire le fond et améliorer la positivité. Mais d'une manière générale, la récupération de colle suffit déjà à réduire cette proportion de support non linéarisé au maximum di et donc inverse.la PCRSupport linéarisé d'origine nous recommandons également le recyclage de colle.

B: insérerADNPréparation des fragments

(1).Le principe général de la conception d'amorces de clonage sans couture en une étape est le suivant: en5 'Introduction terminale d'une séquence homologue terminale du vecteur de clonage linéarisé telle que le fragment inséré amplifie le produit5 'et3 'Séquences homogènes Quan complètes portant respectivement les extrémités extrêmes et les deux extrémités du vecteur de clonage linéarisé(16 points de base)à20 points de base)- Oui.

(2).Conception d'amorces de fragments d'insertion: les amorces de clonage comprennent des séquences d'amorces spécifiques de fragments d'insertion et des séquences de chevauchement.

Clonage des amorces avant(5’-3’): porteur linéaire vers l'avant16-25 ntSéquence de zones de chevauchement(3« la fin compte) +Insérer un fragment séquence d'amorces spécifique vers l'avant (18-25 nt) et

Clonage d'amorces inversées(5’-3’): vecteur linéaire inverse16-25 ntSéquence de zones de chevauchement(3« la fin compte) +Insertion d'un fragment séquence d'amorces inverse spécifique (18-25 nt) et

Remarque: la base de la zone de chevauchement est au moins16 pbEt entre les zones de chevauchement Multi - segments,TmLes valeurs doivent être cohérentes et >60°C (paire AT = 2°C et paire GC = 4°C), sinon, le nombre de bases peut être prolongé jusqu'à ce qu'il soit conforme.

Suivant la structure de l'extrémité du support linéaire (5« saillant,3« saillant, extrémité plate), conception d'amorce également divisée3Un cas, schématisé comme suit:

Linéariser les deux extrémités du vecteur de manière linéaire (par exemple, Single enzyme Cut, double Enzyme Cut, Reverse)la PCR), différent, peut être la combinaison arbitraire de deux ou deux des trois structures d'extrémité ci - dessus, le principe de la conception d'amorces spécifiques du fragment d'insertion suit le principe de la conception générale d'amorces.

Lors du calcul de la température de recuit des amorces d'amplification, il suffit de calculer la séquence d'amplification spécifique du gèneTmValeur, la séquence homologue à l'extrémité du vecteur ne doit pas participer au calcul.

(3).Choix des enzymes: Haute fidélité recommandéeADNPolymérase oumélange PCR(numéro de fret:P517-05ouP814-05).

(4).Conditions de réaction: généralement selon les instructions spécifiques à l'utilisation de la polymérase.

(5).Purification du fragment d'insertion

l Facultatif: si le fragment provient d'un plasmide matrice et que ce plasmide présente la même résistance que le vecteur Recombinant, utilisé avant purificationDpn IEndonucléase digère le modèle de plasmide qui réduit le fond et améliore la positivité.

l Si le fragment est unique, il est recommandéla PCRKit de purification des produits (numéro de l'article:DC012-100), le fragment purifié.

l S'il existe une amplification non spécifique, il est recommandé de récupérer le kit avec de la colle (réf. Produit:DC011-100)Recycler les fragments.

l En utilisant cette méthode de clonage, le site de coupe enzymatique utilisé pour linéariser le vecteur sera manquant au moment de l'épissure, s'il existe des exigences strictes pour le site de coupe enzymatique, il est recommandé de prêter attention au choix du site de coupe enzymatique, qui peut être utilisé si nécessaire dansEntre la séquence de la région de chevauchement et la séquence du gène spécifique de l'amorce de clonage inverse positiveAugmenter les bases manquantes pour restaurer le site de coupure enzymatique original (voir les exemples ci - dessous).

l Si le plasmide Recombinant est utilisé pour l'expression de la protéine, faites attention au cadre de lecture lors de la conception de l'amorce, à l'expression de la protéine et à la séquence requise pour la purification (par exemple, le promoteur,RBSSéquences, codons d'initiation, codons de terminaison, étiquettes de protéines, etc.) ne sont pas détruites.

Exemple de conception d'amorces avant (EcoR IOuverture enzymatique):

Comme dans la figure ci - dessus, le porteur est constitué parEcor IOuverture enzymatique, formation5« extrémités saillantes:

Selon les principes de conception ci - dessus, à partir de3« début du calcul, retour en arrière16bp à 25bp(cet exemple utilise20 pbLes extrémités chevauchent la même séquence), il suffit de l'ajouter avant la séquence d'amorce spécifique du fragment cible. Assurer la zone de chevauchementTmLes valeurs restent cohérentes et >60°C (paire AT = 2°C et paire GC = 4°C)- Oui.

Les amorces avant sont spécifiques comme suit:5 'GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGNNNNNNNNNNNNNNNN3 '

Remarque: une fois que la conception d'amorce ci - dessus a terminé la connexion clonale,EcoR ILes sites de coupure enzymatique disparaissent (les sites de coupure enzymatique ne sont pas conservés).

Si la conservation est nécessaireEcoR ISite de coupure enzymatique, nécessaire à l'extrémité du vecteur20 pbDélétion de l'alignement entre les séquences chevauchantes et les séquences d'amorces spécifiques du fragment cibleEcoR ISéquence de sites d'identificationATTC, une fois la connexion clonée terminée,EcoR ILe site de coupure enzymatique demeure (le site de coupure enzymatique est conservé).

Plus précisément comme suit:5 ' GAGCCTAGGTGAGTTGGCCGaattc NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN3 '

Exemple de conception d'amorces inversées (Hind IIIOuverture enzymatique):

Comme dans la figure ci - dessus, le porteur est constitué parHind IIIOuverture enzymatique, formation5« extrémités saillantes:

Selon les principes de conception ci - dessus, à partir de3« début du calcul, retour en arrière16bp à 25bp(cet exemple utilise20 pbLes extrémités chevauchent la même séquence), il suffit de l'ajouter avant la séquence d'amorce spécifique du fragment cible. Assurer la zone de chevauchementTmLes valeurs restent cohérentes et >60°C (paire AT = 2°C et paire GC = 4°C)- Oui.

Les amorces inversées sont spécifiques comme suit:5 'CTGCCATCGGATCGTGCANNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Remarque: une fois que la conception d'amorce ci - dessus a terminé la connexion clonale,Hind IIILes sites de coupure disparaîtront (aucun site de coupure enzymatique n'est conservé).

Si la conservation est nécessaireHind IIISite de coupure enzymatique, nécessaire à l'extrémité du vecteur20 pbDélétion de l'alignement entre les séquences chevauchantes et les séquences d'amorces spécifiques du fragment cibleHind IIISéquence de sites d'identificationagctt,Hind IIILe site de coupure enzymatique demeure (le site de coupure enzymatique est conservé).

Plus précisément comme suit:5 ' CTGCCATCGGATCGTTCGCA agctt NNNNNNNNNNNNNNNN 3'

Étapes opératoires pour une réaction de clonage sans soudure:

Attention:2 × Mélange de clonage OneStepContient un renfort de connexionPEGTrès visqueux, sortir du réfrigérateur lorsque la température est basse est plus visqueux, peut être mis dans la congélation à la main pendant quelques minutes pour augmenter la température peut réduire la viscosité (sans affecter la qualité), mélanger doucement, centrifuger instantanément recueillir au fond du tube.

1. Etablir le système réactionnel selon le tableau ci - dessous (peut être utiliséla PCRTube formulé à température ambiante)

* Porteur usage général20-50 ng, le rapport molaire du fragment inséré au support est2: 1 - 3: 1Le meilleur entre; Si le fragment inséré est inférieur à200bp, rapport molaire du fragment d'insertion au vecteur5: 1- Oui.

2. Mélanger doucement, dans50°CLa réaction15Minutes (disponible enla PCREffectué sur l'instrument), après la fin de la réaction, serala PCRTransformation directe sur glace tubulaire ou Conservation-20°C. segments plus courts par exemple100bp-1kbSeulement nécessaire15Minutes pour obtenir suffisamment de convertisseurs, ligatures de fragments plus longs, peut prolonger le temps de réaction à60Minutes.

3. 取5 μlLes produits de la réaction sont transformés conformément aux instructions pour les cellules réceptrices (s'il y a moins de transformants, tous les produits peuvent être transformés et tout le liquide de transformation peut être enduit de plaques).

Identification des clones positifs:

Selon les cas, les colonies peuvent être sélectionnéesla PCRIdentification, extraction du plasmide (numéro de produit31013 - 100), effectuer une identification par endonucléase de restriction ou une identification par séquençage.

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