Kit de clonage rapide en une étape

Conditions de stockage et de transport:-20℃

Composition du produit:Kit de clonage rapide en une étape

Présentation du produit

Kit de clonage rapide en une étape

La technique de clonage sans soudure basée sur le principe de recombinaison, en tant que méthode de clonage de nouvelle génération, ne dépend pas d'un clivage enzymatique fastidieux, d'une étape de ligation et n'a pas besoin d'une opération d'égalisation de compensation terminale, basée sur la recombinaison d'un fragment d'ADN avec une séquence homologue de 15 ~ 25 nt à l'extrémité d'un vecteur linéarisé, peut Cloner le fragment inséré à n'importe quel site d'un vecteur linéaire arbitraire, le fond d'auto - ligation du vecteur est extrêmement faible, c'est une

Kit de clonage rapide en une étapeUn kit de clonage sans soudure qui complète la recombinaison d'un seul ou plusieurs fragments d'ADN en une seule réaction, en seulement 5 minutes et avec un taux de positivité supérieur à 95%. Cofacteurs ajoutés au kit, efficaces pour augmenter le taux de positivité clonale; Système réactionnel optimisé, capable de tolérer dans une certaine mesure les impuretés contenues dans les produits de PCR Non purifiés. La version améliorée du kit de clonage sans couture a un taux de positivité plus élevé, une meilleure compatibilité.

Étapes expérimentales

1. Résumé du processus expérimental

2. Préparation de vecteurs de clonage linéarisés

Le site de clonage approprié est choisi, le vecteur est linéarisé, la linéarisation du vecteur pouvant être réalisée par clivage enzymatique ou amplification PCR inverse.

① préparation enzymatique

Certaines endonucléases de restriction ne digèrent pas efficacement l'ADN hyperhélicoïdal et peuvent donc laisser des quantités variables d'ADN vecteur non coupé, ce qui réduit le taux de positivité. Le clivage enzymatique (Single ou double clivage enzymatique) avec l'endonucléase rapide lightningtm est recommandé pour linéariser le vecteur afin de réduire le fond de transformation (Clones faux positifs obtenus par transformation du vecteur non clivé).

Note 1: les vecteurs linéarisés par clivage enzymatique n'ont pas besoin d'être déphosphorylés et une double clivage enzymatique est recommandée.

Note 2: une fois le clivage enzymatique terminé, il est recommandé d'utiliser l'endonucléase après inactivation ou purification du produit d'intérêt pour la réaction de recombinaison.

② préparation de l'amplification PCR inverse

Pour réduire l'introduction de mutations amplifiées, l'amplification par PCR mix haute fidélité est recommandée. L'utilisation de plasmides pré - linéarisés comme matrice est recommandée pour réduire l'effet des résidus de matrice de plasmide cyclique sur le taux de positivité clonale.

Note 1: lorsqu'il n'y a pas de bandes non spécifiques pour les produits de PCR, le modèle de plasmide digestif Template Eliminator (réf.: eg21203) est recommandé pour les réactions de recombinaison; Il est par contre recommandé d'utiliser le produit PCR après purification.

Note 2: pour le clonage multifragment, il est recommandé d'utiliser le produit de PCR après purification.

3. Insérer le fragment PCR amorce Design

L'extrémité 5 'de l'amorce de PCR doit contenir une séquence de 15 ~ 25 nt (18 nt recommandés) homologue à l'extrémité de son fragment voisin (fragment d'insertion ou vecteur). Si le support est visqueux et que l'extrémité 3 'est en saillie, la conception de l'amorce doit contenir une partie en saillie; Si l'extrémité 5 'est en saillie, la conception de l'amorce peut ou non contenir des Parties en saillie.

Insérer le fragment avant amplification amorce:

5 'séquence homologue terminale du vecteur amont + site de coupure enzymatique (facultatif) + séquence d'amplification directe spécifique du gène 3'

Insertion du fragment amorce d'amplification inverse:

3 'séquence d'amplification inverse spécifique du gène + site de coupure enzymatique (facultatif) + séquence homologue terminale du vecteur aval 5'

Note 1: essayez de sélectionner des régions sans séquence répétitive et avec une teneur en GC uniforme pour le clonage, la recombinaison est élevée lorsque la teneur en GC est de 40% ~ 60% dans la région de 25 nt en amont et en aval du site de clonage du vecteur;

Note 2: la séquence d'extrémité de connexion du vecteur PUC 19 (ampr) fournie avec ce kit est la suivante:

4 amplification PCR du fragment inséré

L'amplification par PCR mix haute fidélité est recommandée pour réduire l'introduction de mutations amplifiées. Une réaction de clonage sans soudure avec le produit PCR purifié est recommandée et peut être utilisée directement si le produit PCR est identifié comme un produit d'amplification spécifique par électrophorèse sur gel d'agarose, mais le volume d'addition ne doit pas dépasser 20% du volume réactionnel total.

5 réactions de restructuration

① configurer le système réactionnel suivant dans un bain d'eau glacée:

A. quantité optimale de support (ng) = 0,02 × logarithme de base du support, soit 0,03 PMOL.

B. insérer un seul fragment, quantité optimale de fragment (ng) = 0,04 × logarithme de base du fragment; Insérer plusieurs fragments, chaque fragment zui quantité applicable (ng) = 0,02 × logarithme de base du fragment.

Note 1: si la longueur du fragment inséré est supérieure à celle du support, les quantités de support et de fragment inséré doivent être interchangeables;

Note 2: si la longueur du fragment inséré est inférieure à 200 pb, le fragment inséré doit être utilisé avec 5 fois la quantité de vecteur utilisée;

Note 3: si la quantité calculée selon la formule ci - dessus dépasse/ valeur la plus élevée, il est alors recommandé d'appuyer directement surZui/ utilisation la plus élevée;

Note 4: la positivité clonale est diminuée par des fragments de vecteur trop longs, des fragments d'insertion trop longs ou un nombre excessif de fragments.

Une fois la formulation du système réactionnel reconstitué terminée, mélanger les composants avec un pistolet à pipette en aspirant doucement, éviter de créer des bulles d'air, ne jamais vortex.

② placez le système réactionnel à 50 ℃, la réaction 5 ~ 60 min.

Note 1: il est recommandé d'utiliser des instruments précis pour la comparaison à température contrôlée, tels que les PCR, et l'efficacité de clonage peut être réduite par des temps de réaction insuffisants ou trop longs;

Note 2: le temps de réaction recommandé est de 5 ~ 15 min lors de l'insertion de 1 ~ 2 fragments; Lorsque 3 ~ 5 fragments sont insérés, le temps de réaction recommandé est de 15 ~ 30 minutes;

Note 3: lorsque le squelette porteur est supérieur à 10 KB ou que le fragment inséré est supérieur à 4 KB, il est recommandé de prolonger le temps de réaction de 30 à 60 minutes;

Note 4: une fois la réaction terminée à 50 °C, il est recommandé de procéder à une centrifugation instantanée, le liquide réactionnel étant recueilli au fond du tube.

③ le tube de centrifugation du liquide réactionnel est refroidi sur de la glace, après quoi il est converti ou stocké à - 20°C.

Note 1: produit reconstitué stocké à - 20 ° C, recommandé dans les 1 semaine.

6. Transformation des produits reconstitués

Prenez 5 ~ 10 μl de liquide réactionnel, ajoutez - le à 100 μl de cellules sensibles, aspirez lentement et mélangez, placez - le sur la glace pendant 30 minutes. 42 ℃ stimulation thermique 45 ~ 60 sec, bain de glace 5 min. Ajouter 500 μl de milieu SOC ou LB, 37 ℃ culture oscillante 40 ~ 60 min (200 RPM). Le liquide bactérien est uniformément étalé sur des plaques contenant l'antibiotique correspondent et incubé à 37°c pendant une nuit à l'envers.

Note 1: le taux de positivité clonale finale varie d'une cellule réceptrice à l'autre et il est recommandé d'utiliser des cellules réceptrices dont l'efficacité de transformation est > 108 UFC / μg;

Note 2: le nombre de colonies dépend de la quantité et de la pureté du produit PCR par rapport au support linéarisé;

Note 3: les plaques témoins positives cultivent généralement un grand nombre de monocolonies blanches et les plaques témoins négatives ne cultivent que très peu de colonies.

7. Test de clonage positif

Les monocolonies ont été sélectionnées pour malaxer dans 10 µl de DDH 2 O et, après 10 min de lyse à 95°c, 1 µl de lysat a été prélevé comme matrice pour l'identification par PCR des colonies ou après ensemencement des monocolonies pour une nuit de culture en milieu résistant, les plasmides ont été extraits pour l'identification enzymatique.

Tests de clonage positifs pour les contrôles positifs, les amorces PCR des colonies ont été utilisées avec les amorces génériques m13f et m13r, et l'enzyme a été identifiée avec HindIII et ecori.

Note 1: il est recommandé d'utiliser au moins une amorce générique lors de la PCR des colonies pour éviter les résultats faussement positifs;

Note 2: l'identification par séquençage des résultats positifs peut être poursuivie si nécessaire.

注3： M13F : TGTAAAACGACGGCCAGT

M13R : CAGGAAACAGCTATGAC

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