Colorant Fluorescent pour structure tissulaire locale histobright

Colorants fluorescents permettant la visualisation de la structure tissulaire locale

HistoBright

Histobright est un fluorochrome de coloration membranaire réactif à l'environnement qui permet une excitation biphotonique avec une excellente perméabilité tissulaire qui modifie les propriétés de fluorescence en fonction de la structure locale du tissu et permet ainsi une visualisation tissulaire à contraste élevé. En combinaison avec le traitement de transparence tissulaire et l'utilisation de la microscopie laser à deux photons, l'observation en profondeur et l'analyse de la structure spatiale des blocs tissulaires sont possibles.

※Ce produit est basé sur les résultats de la recherche de l'Université de Kochi et de l'Université Ehime et est fabriqué et commercialisé par Funakoshi (plante).

※Ce produit est destiné à un usage de recherche uniquement et ne peut pas être utilisé à des fins autres que la recherche.

Histobright est un colorant Fluorescent réactif à l'environnement qui affiche une large gamme de longueurs d'onde en fonction de la polarité du solvant. Lorsqu'elle est appliquée à des tissus traités par transparence, la fluorescence change en réponse au microenvironnement à l'intérieur des tissus, puis en conjonction avec la double lumièreLe microscope à sous - laser permet d'observer clairement la structure des tissus.

◆ méthodes traditionnelles d'analyse de structure organisationnelle et nouveaux types d'analyse de structure organisationnelle 3D

L'analyse traditionnelle de la structure des tissus, réalisée par coloration des tissus à l'aide de colorants colorés, comme la méthode de coloration à l'hématonine (he). Et l'utilisation de ces colorants colorés est difficile de teindre le bloc de tissu entier, généralement besoin de faire des tranches minces après l'observation. Mais les tranches minces peuvent facilement perdre des informations tridimensionnelles sur la structure des tissus, il est donc nécessaire de préparer un grand nombre de tranches pour recréer la structure tridimensionnelle.

Histobright est un nouveau colorant Fluorescent réactif à l'environnement synthétisé par le Dr renzi Yangji du Département de recherche en éducation de l'Université de Kochi (le composé dans le document original s'appelle PC), actuellement promu par le Dr kenshi Imamura, le Dr Masaki Murakami, le Dr ryasuke Kawasaki du Département de médecine de l'Université Ehime Pour le développement de colorants d'imagerie fluorescente appliqués à la structure tissulaire tridimensionnelle. Histobright s'accumule sur le biofilm et varie en fonction de l'environnement local dans lequel il se trouve, la fluorescenceLumière verte~Lumière proche infrarougeVariations à grande échelle. Ainsi, lorsque histobright est appliqué sur des tissus biologiques, il peut induire des variations de teintes de fluorescence en fonction de la structure des tissus, ce qui permet une observation très contrastée de la structure des tissus. Comme histobright est capable d'excitation à deux photons, l'observation peut être effectuée avec un microscope laser à deux photons en plus d'un Microscope confocal laser. De plus, en collaboration avec le traitement de transparence tissulaire (en plus de la méthode de maintien de la structure de la membrane pour les opérations de dégraissage), l'utilisation d'histobright permet d'observer des échantillons de tissus épais sans détruire la structure tissulaire (sans préparer de fines tranches) et de réaliser une analyse structurale tridimensionnelle des tissus par imagerie en profondeur par microscopie laser à deux photons.

◆ caractéristiques

● réactif de teinture de membrane sensible à l'environnement, peut montrer selon l'environnement environnantLumière verte~Lumière proche infrarougePropriétés fluorescentes. Des jonctions tissulaires locales à contraste élevé peuvent être obtenues en distinguant la gamme de longueurs d'onde de fluorescence à détecter

Construction de la visualisation.

●Les traitements de transparence tissulaire sans dégraissage (tels que rapiclear (sunjin Lab), Lucid, etc.) permettent une analyse 3D approfondie de la structure tissulaire.

●※ l'utilisation de tensioactifs (Triton X - 100, Tween 20, etc.) dissout les membranes lipidiques dans les tissus et peut avoir un effet sur la coloration de histobright, il est donc déconseillé. Pour utilisation, veuillez discuter des conditions applicables.

●Les observations peuvent être effectuées avec un Microscope confocal laser (Laser 488 nm recommandé) ou un microscope laser à deux photons (Laser 960 nm recommandé).

●Lorsqu'il est observé avec un microscope laser à deux photons, il peut être combiné avec l'imagerie de deuxième harmonigenèse (SHG) pour observer les fibres de collagène dans les tissus non colorés tout en utilisant ce réactif.

●Après coloration et observation avec histobright, une coloration He est possible.

◆ original original

Inoue, K.,et al., J. Mater. La chimie.B.,10(10), 1641～1649 (2022). Synthèse et propriétés photophysiques d'un nouveau colorant pyrénique push-pull à émission vert-à-rouge lointain et son application à l'imagerie cellulaire humaine et des tissus cutanés. [PMID :35194628]

◆ Principe

Spectre d'excitation / émission

Histobright est un colorant Fluorescent réactif à la polarité du solvant qui modifie les propriétés de fluorescence en fonction de la polarité moléculaire du solvant. Selon la polarité du solvant, la fluorescence va devert(faible polarité) versLumière proche infrarougeLa gamme (haute polarité) a considérablement changé.

Variations du spectre de fluorescence dans un modèle de membrane Liposomale

Histobright montre une affinité élevée pour les membranes lipidiques et présente différentes propriétés de fluorescence en fonction de l'état de phase des membranes lipidiques. Contrairement aux maximums de fluorescence dans les liposomes du modèle lo en phase ordonnée (sphingomyéline (SM) / Chol - solid - ol (Chol)), les longueurs d'onde maximales dans les liposomes du modèle LD en phase désordonnée (dopc) ont également été transférées dans la longue gamme de longueurs d'onde d'environ 30 nm et Le rendement quantique de fluorescence a également diminué de 0,72 (SM / Chol) à 0,37 (dopc).

※ les données spectrales de fluorescence ci - dessus ont toutes été fournies par le Dr renzi yangjie de l'Université de Kochi.

◆ données d'application

Imagerie de tissus cutanés humains normaux transparents à l'aide d'un microscope laser à deux photons

Après fixation d'un bloc de tissu cutané humain normal à l'aide de Paraformaldehyde / PBS à 4%, on prépare des coupes de 500 µm, accompagnées d'un traitement de transparence tissulaire (Lucid) de 76 H et d'une coloration histobright (10 µm). Par microscopie laser à deux photons, les blocs de tissus sont excités par un laser à 960 nm, respectivement à 492 nm (SHG:Couleur Cyan）、500-550 nm（vert）、560~593nm（orange) et 593 - 690 nm (rouge), où les images de fluorescence sont prises séparément, faire les 4 images composites suivantes.

※ 492 nm（Couleur Cyan), provenant du signal SHG des fibres de collagène dans les tissus et non du signal de fluorescence d'origine histobright.

Ensuite, des images de 500 µm ont été prises en continu dans la direction de l'axe Z à des intervalles de 5 µm à l'aide d'un microscope laser à deux photons et construites en trois dimensions à l'aide d'un logiciel d'analyse d'images pour visualiser la structure fine du tissu cutané humain en trois dimensions.

Imagerie 3D de tissus cutanés humains normaux transparents à l'aide d'un microscope laser à deux photons

Après fixation d'un bloc de tissu cutané normal humain à 4% de Paraformaldehyde / PBS, des coupes de 1 mm ont été préparées en même temps que 72 H de traitement de transparence tissulaire (rapiclear, société sunjin Lab) *, de coloration histobright (10 µm) et de coloration nucléaire (hoechst33342). Les blocs de tissus sont excités par laser à 1100 nm par microscopie laser à deux photons, respectivement à < 492 nm (SHG:Couleur Cyan）、500~550 nm（vert）、560~593 nm（orange) et 593 - 690 nm (rouge), où les images de fluorescence sont prises séparément, faire les 4 images composites suivantes. Sur la base des conditions ci - dessus, la prise de vue en continu à des intervalles de 5 µm dans la direction de l'axe Z, construite en trois dimensions à l'aide d'un logiciel d'analyse d'image, anime les données successives.

* Le bloc de tissu dans cette expérience n'a pas subi de traitement perméable après la fixation, le traitement de transparence directe et la coloration.

Voir la vidéo complète ici: labchem.fujifilm-wako.com.cn / product / show / 1646.html

Répété pour teinture He

Utilisez histobright pour colorer et observer un bloc de tissu cellulaire normal de la peau humaine, laisser reposer dans du PBS et enlever le réactif de transparence. Il est ensuite préparé en fines tranches pour la coloration He. Une fois la coloration histobright confirmée, une coloration He claire peut encore être effectuée.

Observation de la coloration en microscopie confocale laser et en microscopie laser à deux photons

Après fixation d'un bloc de tissu cutané humain normal à l'aide de Paraformaldehyde / PBS à 4%, on prépare des coupes de 0,5 mm, accompagnées d'un traitement de transparence tissulaire de 72 H (rapiclear, sunjin Lab Inc.) * et d'une coloration histobright (10 µm). Les observations ont ensuite été réalisées en microscopie confocale laser (à gauche: laser à lumière excitée 488 nm) et en microscopie laser biphoton (à droite: laser à lumière excitée 960 nm). Bien que les deux images ne soient pas clairement différenciées, le signal SHG (fibre de collagène) excité par deux photons peut être observé sous un microscope laser à deux photons.

* Le bloc de tissu dans cette expérience n'a pas subi de traitement perméable après la fixation, le traitement de transparence directe et la coloration.

※ les données d'image ci - dessus ont été fournies par le Dr Ryosuke Kawasaki de l'Université Ehime.

◆ liste des produits