Ensemble de milieu de culture organoïde pour carcinome biliaire intra - hépatique biologique à matrice

Kit organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique humain

Ensemble de milieu de culture organoïde pour le cholangiocarcinome intrahépatique humain

1, Description du produit

Kit de milieu de culture organoïde pour carcinome biliaire intra - hépatique humain à base de moule bio (Kit organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique humain), un milieu de culture cellulaire chimiquement défini pour l'établissement et le maintien des organoïdes du cholangiocarcinome intrahépatique humain. Les organoïdes tumoraux d'origine patiente résument les caractéristiques génomiques et pathologiques des tumeurs primitives et sont donc très prometteurs pour la recherche médicale et la médecine de précision.

2, Informations sur le produit

3, Autres matériaux et réactifs autonomes

4, Préparation de milieux de culture d'organoïdes de cholangiocarcinome intrahépatique humain

Le milieu de culture organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique a été formulé en utilisant des techniques de manipulation stériles. Voici la formulation10 mlDes exemples de milieux de culture, si la quantité requise est différente, peuvent être ajustés en conséquence.

1, Décongélation sur glace facteur de culture organoïde du cholangiocarcinome intrahépatiqueB(50x)Et facteur de culture organoïde du cholangiocarcinome intrahépatiqueC(250x)- Oui.

Remarque: Après décongélation, il est recommandé de cultiver des facteurs organoïdes de cholangiocarcinome intrahépatiqueB(50x)Facteurs de culture des organoïdes du cholangiocarcinome intrahépatiqueC(250x). conserver pour l'utilisation après le chargement séparé, éviter la congélation et la dégel répétées.

2, Sera200 uLFacteur de culture organoïde du cholangiocarcinome intrahépatiqueB(50x),40μLFacteur de culture organoïde du cholangiocarcinome intrahépatiqueC(250x)Ajouter à9,76 mlCholangiocarcinome intrahépatique dans un milieu de culture de base de culture organoïde, bien mélangé, formulé pour10 mlMilieu de culture organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique.

Remarque: le milieu de culture organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique après formulation peut être utilisé dans2-8°CStockage, recommandé dans les deux semaines. Facteur de culture organoïde du cholangiocarcinome intrahépatiqueB(50x)Contient des antibiotiques bactériens et fongiques.

5, Culture primaire d'organoïdes cholangiocarcinomes intrahépatiques d'origine patiente

Remarque: les études impliquant des matériaux de tissus humains primaires doivent suivre toutes les réglementations institutionnelles et gouvernementales pertinentes. Le consentement éclairé de tous les sujets doit être obtenu avant la collecte des principaux tissus humains.

a) Établissement d'organoïdes de cholangiocarcinome dans le foie humain primaire

1, Des fragments de tissu de type cholangiocarcinome intrahépatique primaire ont été recueillis dans une solution de stockage de tissu primaire glacée à l'aide d'un tube à centrifuger. Garder l'échantillon de tissu à4℃Jusqu'à ce que la séparation commence.

2, Évaluer si les fragments de tissus obtenus sont constitués d'épithélium. Si la graisse ou le tissu musculaire est présent, utilisez un couteau ou une pince à épithélium sous un microscope anatomique pour éliminer autant de ces composants non épithéliaux que possible. S'il n'y a pas de graisse ou de tissu musculaire, passez immédiatement à l'étape suivante.

3, Avec le milieu de base des organoïdes épithéliaux ouDPBSRincez le tissu deux fois.

4, Utilisez un couteau ou Coupez le tissu en1 à 3 mm³Petits morceaux, placés dans une boîte de pétri cellulaire.

5, Dans37℃Utilisation inférieure10 mlSolution Digestive de tissu tumoral dans15 mlDigestion de fragments de tissus dans un tube à centrifuger, temps de digestion variable, à partir de30Minutes à1.5Les heures varient. Surveiller attentivement le processus de digestion, peut souffler correctement pour observer le degré de digestion. Lorsque la plupart des fragments de tissus sont capables de passer1 mlLorsque la pipette aspire la tête, le processus de digestion est terminé.

6, SeraFBSAjouter au mélange de digestion tissulaire, la concentration finale étant2%Et utiliser100 μmFiltration des filtres cellulaires.

7, Collecter et dans4°CInférieur à250gCellules filtrées par centrifugation3Minutes. En cas de précipité rouge visible, inhaler le surnageant et utiliser2 mlPrécipité de resuspendation du lysat de globules rouges, lyse des globules rouges à température ambiante1Minutes et dans4°CInférieur à250gCentrifugation3Minutes.

8, Aspirer le surnageant et remettre le précipité en suspension dans le milieu de base, dans4°CInférieur à250gCentrifugation3Minutes, répétez à nouveau.

9, Le surnageant est aspiré et le précipité est remis en suspension dans la colle matricielle. La Colle de matrice doit être conservée sur la glace pour éviter sa coagulation. Faites le processus le plus rapidement possible. La quantité de colle matricielle utilisée dépend de la taille des particules. Environ10，000Les cellules doivent être inoculées dans25 μLDans la colle de matrice.

10, Ne pas trop diluer la colle de matrice (la proportion de colle de matrice doit être> 70%(volume de colle de matrice/Volume total)), car cela peut inhiber la formation correcte de gouttelettes solides. étaler la colle matricielle contenant les organoïdes sur24Fond d'une plaque de culture cellulaire de puits, chaque goutte entourant le Centre du puits environ30μL- Oui.

Remarque: une fois que les organoïdes sont remis en suspension dans la colle matricielle, effectuez la germination dès que possible, car la colle matricielle peut se solidifier dans le tube à essai ou la tête d'aspiration de la pipette. Ne laissez pas les particules de matrice toucher la paroi du tube.

11, Placer la plaque de culture dans37°Cet5 % de CO₂Dans l'incubateur15 à 25Minutes, laissez le gel de matrice se solidifier.

12, Préparer la quantité requise de milieu organoïde pour le cholangiocarcinome intrahépatique.

13, Une fois que les gouttelettes de gel de matrice sont coagulées (15 à 25Minutes), ouvrez la plaque et ajoutez - la soigneusement dans chaque trou500 μLMilieu de culture organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique.

Remarque: n'ajoutez pas le milieu de culture directement sur le dessus des gouttelettes de gomme matricielle, car cela pourrait endommager la structure coagulée.

14, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans un incubateur à température constante.

15, Chaque fois3 - 4Changez le milieu une fois par jour, aspirez soigneusement le milieu du puits et remplacez - le par un milieu frais et préchauffé d'organoïdes.

16, Surveiller de près l'état de croissance des organoïdes, idéalement, les organoïdes du cholangiocarcinome intrahépatique devraient être7 à 10Construit en jours.

b) Culture de passage d'organoïdes de cholangiocarcinome dans le foie humain

1, On prélève les organoïdes à gratter par soufflage à l'aide d'une tête de pistolet lavée avec une lotion lubrifiante et on transfère la suspension d'organoïdes et de milieu de culture à ceux qui ont été lavés avec une lotion lubrifiante1,5mLEPDans le tube.

2, La suspension d'organoïdes est fortement remise en suspension avec une tête de pistolet lavée avec une lotion lubrifiante, de sorte que les organoïdes se séparent de la colle matricielle.

3, 250gForce centrifuge centrifugation à température ambiante3 minutes- Oui.

4, Défaussez le nettoyage, utilisez des sucs digestifs organoïdes ou détruisez mécaniquement. Pour la dissociation cellulaire utilisant le digestif organoïde, la suspension d'organoïde est remise en suspension dans le digestif organoïde, la pipette est soufflée à plusieurs reprises de haut en bas et juxtaposée à37°CIncuber jusqu'à dissociation des organoïdes. Utilisation d'une tête de pistolet à cartouche filtrante chaque2Minute soufflage répété vers le haut et vers le bas8Secondaire, pour aider à la dissociation des organoïdes. Une surveillance étroite du processus digestif permet une incubation minimale dans le liquide dissociatif organoïde. En cas de défaillance mécanique, en1,5 mlSuspension d'organoïdes en milieu basal épithélial. Aspirer soigneusement la suspension d'organoïdes avec une pipette, de haut en bas à plusieurs reprises30Une fois, cela aidera à la digestion.

Remarque: ne pas dissocier plus de liquide dissociatif organoïde7Minutes, car cela peut entraîner la croissance ou même la destruction des organoïdes pauvres. Par expérience, si c'est un mélange de petites cellules, on peut observer que10 à 50Une masse de cellules, la digestion est terminée.

5, Une fois la digestion terminée, utilisez1 mlMilieu de base des organoïdes épithéliaux soumis à un rinçage puis à température ambiante250gCentrifugation3Minutes.

6, Abandonner le débridement, resuspendre les organoïdes précipités avec une quantité appropriée de colle matricielle, remettre sur la glace après resuspendation, ne pas dépasser le temps de resuspendation30 ansPour éviter une coagulation prématurée du gel de matrice.

Remarque: la proportion de dilution de la colle de matrice doit être70%Ci - dessus pour garantir la stabilité structurelle de la colle matricielle pendant la culture.

7, Spot suspension mixte de colle matricielle et organoïdes dans48Fond de la plaque d'orifice positif, éviter que la suspension touche la paroi latérale de la plaque d'orifice, chaque trou15-20uLGauche et droite. Remarque: pour éviter que la colle de matrice ne se solidifie à température ambiante, cette étape doit être effectuée dès que possible.

8, Plaque de culture après la fin de l'inoculation quant à37℃Dans un incubateur thermostaté au dioxyde de carbone, incubé15 minutesGauche et droite à gélifier le substrat.

9, Formuler un milieu de culture d'organoïdes de cholangiocarcinome intrahépatique.

10, Après gélification du substrat à gélifier, on ajoute le milieu de culture organoïde de cholangiocarcinome intrahépatique humain déjà formulé,48Plaque ajoutez par trou250 uLMilieu de culture.

11, Sera48Plaque de trou placée37℃Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone jusqu'à ce que les organoïdes nécessitent d'autres expériences.

V2.0Edition

Temps de mise à jour:2025 / 6 / 21