Kit de milieu de culture d'organoïdes du côlon humain Modular bio plus (amplifié)

Kit Organoïde Colonique Humain Plus(Expansion) et

Ensemble de milieu de culture d'organoïdes du côlon humainPlus(amplifié)

1, Description du produit

Ensemble de milieu de culture d'organoïdes du côlon humain à base de moule BioPlus(amplification) […]Kit Organoïde Colonique Humain Plus (Expansion) Plus] est un milieu de culture pour l'amplification des organoïdes du côlon humain, les organoïdes du côlon humain au moment de l'amplification se composent principalement de cellules souches du côlon et de cellules progénitrices du côlon. Les organoïdes du côlon recréent les caractéristiques de l'épithélium du côlon in vivo en termes de capacité d'auto - renouvellement et de différenciation, de structure tissulaire, de type cellulaire et de fonction, et sont donc un modèle in vitro idéal pour l'étude du côlon humain.

2, Informations sur le produit

3, Autres réactifs et consommables autonomes

4, Mode d'emploi milieu de culture d'organoïdes du côlon humain (amplification)

1, Après réception du milieu de culture organoïde, le milieu est placé4℃ réfrigérateur pour décongeler.

2, Mélanger bien à l'envers Après décongélation du milieu à cultiver, dans une armoire de sécurité biologique ou un plan de travail propre selon les besoins quotidiens, sous - ensemble recommandé10 mL/Le tube.

3, Milieu de culture après le fractionnement s'il vous plaît stocker après scellé dans-20℃, retirer le milieu de culture fractionné lors de l'utilisation est prêt à être utilisé après avoir été placé à l'équilibre de la température ambiante.

5, Établissement et culture de passage des organoïdes du côlon humain

Remarque: les études impliquant des matériaux de tissus humains primaires doivent se conformer à toutes les réglementations institutionnelles et gouvernementales pertinentes. Le consentement éclairé de tous les sujets doit être obtenu avant la collecte des principaux tissus humains.

a) Établissement des organoïdes du côlon chez les humains primaires

1, Les échantillons de tissus primaires doivent être in vitro5 minutesMettre à l'intérieur du liquide de conservation des tissus vivants avec prérefroidissement (2-8℃) dans le tube d'échantillon, l'échantillon doit être recouvert de biopsie (si l'échantillon a déjà été placé dans un autre tampon ou milieu de culture, remplacer la solution entière par du biopsie prérefroidi). Basse température (2~8℃), le transport est transféré au laboratoire.

2, Placer la colle de matrice avant l'expérience4℃Décongeler sur la glace tout en retirant le milieu de culture pour le placer à température ambiante équilibrée. Les tubes à centrifuger, les tubes à essai ou les têtes d'aspiration en plastique qui entrent en contact avec les cellules doivent être utilisés après lavage avec une lotion anti - adhérente pour culture d'organoïdes.

3, Dans un banc de nettoyage, les échantillons sont transférés dans une boîte de Pétri pour évaluer si le tissu obtenu est constitué d'épithélium. Si la graisse ou le tissu musculaire est présent, utilisez un couteau ou une pince à épithélium sous un microscope anatomique pour éliminer autant de ces composants non épithéliaux que possible. S'il n'y a pas de graisse ou de tissu musculaire, passez immédiatement à l'étape suivante.

4, Transfert de l'échantillon de tissu chargé de pré - refroidi avec double antiDPBSDans une boîte de pétri, la cavité intestinale est orientée vers le haut, une main utilise une extrémité du tissu intestinal pincée, l'autre main utilise une feuille pour gratter doucement le mucus ou les selles restantes à la surface de la cavité intestinale, puis placez le tissu du côlon dans un nouveau contenant une double résistanceDPBSNettoyage en boîte de pétri2 - 3Une fois. Briser les intestins lavés à environ2mm * 5mmTaille, puis transfert à50 mlDans le tube centrifuge, violente commotion30s(Commotion verticale vers le haut et vers le bas20Une fois de plus, environ1sTrois fois) etAbandonner, répéter3Une fois.

5, Digestion: ajouter30mldeDPBSRajouter à la solution300 μL 0,5 M EDTA, àEDTALa concentration finale estde 5mM. placer4℃Sur le shaker,80 tours par minute, digestion20 à 30 minutes(selon la taille de l'échantillon, peut être digéré dans20Observer la digestion sous le miroir après le mélange de soufflage en minutes, si vous observez la structure complète de la crypte peut effectuer l'opération suivante).

6, Lavage: une fois la digestion terminée, laisser reposer le segment intestinal pour précipiter et défricher. Ajouter au pré - refroidissementDPBS, agiter doucement, laisser tomber après le repos, répéter2Une fois pour enleverEDTA- Oui.

7, Resurfaçage: rejoindre30mlPré - refroidi contient0,1 % de BSAdeDPBS, le vortex10 ans, enlever le nettoyage.100 μmFiltre filtre, recueillir la suspension tissulaire à travers le filtre, répéter la collecte2Une fois.

8, Collecte:300gForce centrifuge4℃Centrifugation3 minutes- Oui.

9, Aspirer le surnageant et remettre le précipité en suspension dans le milieu de base des organoïdes épithéliaux, prélever la suspension pour le comptage cryptique.

10, 300gForce centrifuge4℃Centrifugation3 minutes, aspirer le surnageant, prendre la quantité appropriée de précipité cellulaire selon les besoins de culture ajouter la colle de matrice (> 70%), et mélanger sur la glace (Note: mélanger l'action de soufflage pour être doux, Cheeky produit beaucoup de bulles d'air, mélanger à température normale doit être contrôlé dans15Dans les secondes), après mélange sur la glace. Remarque: la colle de substrat doit être conservée sur de la glace pour éviter sa coagulation. Faites le processus le plus rapidement possible. Environ50Une crypte doit être inoculée dans25 μLDans la colle de matrice. Ne pas trop diluer la colle de matrice (la proportion de colle de matrice doit être> 70%(volume de colle de matrice/Volume total)), car cela peut inhiber la formation correcte de gouttelettes solides.

11, Pointer une suspension mixte de colle matricielle et de cellules dans le fond de la plaque de culture positive, en utilisant la tête du pistolet pour aplatir légèrement la suspension, en prenant soin d'éviter que la suspension ne touche les parois latérales de la plaque de culture. (recommandé:96Inoculation de plaque de trou3 à 10μL/Le trou,48Inoculation de plaque de trou10 à 20 μL/Le trou,24Inoculation de plaque de trou20 à 30 μL/Le trou).

12, Remarque: une fois que les organoïdes sont remis en suspension dans la colle matricielle, effectuez la germination dès que possible, car la colle matricielle peut se solidifier dans le tube à essai ou la tête d'aspiration de la pipette.

13, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans l'incubateur15 à 25Minutes, laissez le substrat gélifier.

14, Après gélification du substrat à gélifier, le milieu organoïde équilibré à température ambiante est ajouté lentement le long de la paroi pour éviter la destruction de la structure coagulée. (recommandé:96Plaque de trou rejoindre100 μL/Le trou,48Plaque de trou rejoindre250 μL/Le trou,24Plaque de trou rejoindre500 μL/Le trou). Remarque: n'ajoutez pas le milieu de culture directement sur le dessus des gouttelettes de gomme matricielle, car cela pourrait endommager la structure coagulée.

15, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans un incubateur à température constante.

16, Chaque fois2 ~ 3Changez le milieu une fois par jour, aspirez soigneusement le milieu des puits et ajoutez du milieu frais d'organoïde équilibré à température ambiante.

17, Surveiller de près l'état de croissance des organoïdes.

b) Culture de passage d'organoïdes du côlon humain

1, Les organoïdes à cultiver jusqu'à un diamètre de600 μmGrandes heures (ou lorsque le noircissement n'augmente plus), les passages organoïdes peuvent être effectués (environ par génération)1Semaines). Les consommables pour les opérations suivantes en contact avec les cellules doivent être utilisés après lavage avec une lotion lubrifiante:

2, Aspirer l'ancien milieu, ajouter un volume égal de milieu de base d'organoïdes épithéliaux, gratter doucement (ou souffler) la colle de matrice et le mélange d'organoïdes avec un racleur cellulaire ou une tête d'aspiration de pipette, transférer à1,5 mlDans des tubes centrifuges (collecte maximale par tube2 ~ 3Organoïdes poreux, éviter le volume excessif faible efficacité Digestive), soufflé5 à 10Secondaire, séparer les organoïdes et la colle stromale,300gCentrifugation3Minutes.

3, Enlever le surnageant ajouter5Volume de liquide digestif organoïde égal au volume du mélange de gomme matricielle et organoïde, après mélange par soufflage37℃Digestion en incubateur3Minutes. Retirer le mélange soufflé, prendre10 μLLa microscopie liquide mixte est - elle digérée en300 μmGroupes d'organes gauche et droit.

Remarque: une étape de resurfaçage précipitation doit contrôler la force et le nombre de coups, est le contrôle des agrégats d'organes dans la taille300 μm左右。

4, Une fois la digestion terminée, ajouter5Volume multiple milieu de base d'organoïdes épithéliaux mélangé par soufflage doux pour mettre fin à la réaction digestive, puis250gCentrifugation3Minutes.

5, Aspiration du surnageant, lavage avec le milieu de base des organoïdes épithéliaux2Une fois pour enlever le suc digestif résiduel. Un lavage secondaire peut combiner les organoïdes et les collecter dans le même tube de centrifugation.

6, Les cellules du précipité centrifugé sont soumises à une culture de passage une fois le lavage terminé, la colle matricielle est ajoutée au précipité cellulaire (> 70%), et mélanger sur la glace (Notez que l'action de soufflage de mélange doit être douce, Cheeky produit beaucoup de bulles d'air, le mélange à température normale doit être contrôlé dans15Dans les secondes), après mélange sur la glace. Remarque: la proportion de dilution de la colle de matrice doit être70%Ci - dessus pour garantir la stabilité structurelle de la colle matricielle pendant la culture.

7, Pointer une suspension mixte de colle matricielle et de cellules dans le fond de la plaque de culture positive, en utilisant la tête du pistolet pour aplatir légèrement la suspension, en prenant soin d'éviter que la suspension ne touche les parois latérales de la plaque de culture. (recommandé:96Inoculation de plaque de trou3 à 10μL/Le trou,48Inoculation de plaque de trou10 à 20 μL/Le trou,24Inoculation de plaque de trou20 à 30 μL/Le trou). Environ50Inoculation de masses d'organes dans25 μLDans la colle de matrice. Remarque: pour éviter que la colle de matrice ne se solidifie à température ambiante, cette étape doit être effectuée dès que possible.

8, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans l'incubateur15 à 25Minutes, laissez le substrat gélifier.

9, Après gélification du substrat à gélifier, le milieu organoïde équilibré à température ambiante est ajouté lentement le long de la paroi pour éviter la destruction de la structure coagulée. (recommandé:96Plaque de trou rejoindre100 μL/Le trou,48Plaque de trou rejoindre250 μL/Le trou,24Plaque de trou rejoindre500 μL/Le trou). Remarque: n'ajoutez pas le milieu de culture directement sur le dessus des gouttelettes de gomme matricielle, car cela pourrait endommager la structure coagulée.

10, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans un incubateur à température constante.

11, Chaque fois2 ~ 3Changez le milieu une fois par jour, aspirez soigneusement le milieu des puits et ajoutez du milieu frais d'organoïde équilibré à température ambiante.

12, Surveillez de près l'état de croissance des organoïdes jusqu'à ce que les organoïdes nécessitent la prochaine étape de l'expérience.

V2.0Edition

Temps de mise à jour:2025 / 6 / 12