Ensemble de milieu de culture d'organoïdes gastro - épithéliaux humains à base de moule bio plus

Kit Organoïde Épithélial Gastrique Humain Plus

Ensemble de milieu de culture d'organes épithéliaux gastriques humainsPlus

1, Description du produit

Ensemble de milieu de culture d'organoïdes gastro - épithéliaux humains à base de moule BioPlus(Kit Organoïde Épithélial Gastrique Humain Plus), est un milieu de culture cellulaire chimiquement défini utilisé pour établir et maintenir des organoïdes épithéliaux gastriques humains dérivés de cellules souches adultes. L'auto - renouvellement des cellules épithéliales de l'estomac est entraîné par la prolifération des cellules souches et de leurs précurseurs. Les organoïdes gastro - épithéliaux humains présentent la plupart des caractéristiques de l'épithélium gastrique en termes de structure, de composition des types cellulaires et d'auto - renouvellement. L'espoir est donc offert pour étudier l'homéostasie et la maladie de l'épithélium gastrique humain.

2, Informations sur le produit

3, Autres matériaux et réactifs autonomes

4, Instructions pour l'utilisation du milieu de culture d'organes épithéliaux gastriques humains

1, Après réception du milieu de culture organoïde, le milieu est placé4℃ réfrigérateur pour décongeler;

2, Mélanger bien à l'envers Après décongélation du milieu à cultiver, dans une armoire de sécurité biologique ou un plan de travail propre selon les besoins quotidiens, sous - ensemble recommandé10 mL/Les tubes;

3, Milieu de culture après le fractionnement s'il vous plaît stocker après scellé dans-20℃, retirer le milieu de culture fractionné lors de l'utilisation est prêt à être utilisé après avoir été placé à l'équilibre de la température ambiante.

5, Établissement et culture de passage d'organes épithéliaux de l'estomac humain

Remarque: les études impliquant des matériaux de tissus humains primaires doivent suivre toutes les réglementations institutionnelles et gouvernementales pertinentes. Le consentement éclairé de tous les sujets doit être obtenu avant la collecte des principaux tissus humains.

a) Établissement d'organes épithéliaux gastriques chez l'homme primitif

1, Les échantillons de tissus primaires doivent être in vitro5 minutesMettre à l'intérieur du liquide de conservation des tissus vivants avec prérefroidissement (2-8℃) dans le tube d'échantillon, l'échantillon doit être recouvert de biopsie (si l'échantillon a déjà été placé dans un autre tampon ou milieu de culture, remplacer la solution entière par du biopsie prérefroidi). Basse température (2~8℃), le transport est transféré au laboratoire.

2, Placer la colle de matrice avant l'expérience4℃Décongeler sur la glace tout en retirant le milieu de culture pour le placer à température ambiante équilibrée. Les tubes à centrifuger, les tubes à essai ou les têtes d'aspiration en plastique qui entrent en contact avec les cellules doivent être utilisés après lavage avec une lotion anti - adhérente pour culture d'organoïdes.

3, Dans un banc de nettoyage, les échantillons sont transférés dans une boîte de Pétri pour évaluer si le tissu obtenu est constitué d'épithélium. Si la graisse ou le tissu musculaire est présent, utilisez un couteau ou une pince à épithélium sous un microscope anatomique pour éliminer autant de ces composants non épithéliaux que possible. S'il n'y a pas de graisse ou de tissu musculaire, passez immédiatement à l'étape suivante.

4, Avec milieu de base d'organoïdes épithéliaux ou contenant une double résistanceDPBSRincez le tissu deux fois.

5, Transfert de tissus à l'aide de pinces à épiler1,5 mlDans le tube de centrifugation, sur la glace avec stérile sera brisé en0.5~2mm²La taille.

6, Tissu à couper50Resurfaçage du volume de tissu multiplié et transféré à15 mlÀ l'intérieur du tube de centrifugation, souffler le bloc de tissu en suspension. À37℃,100 tours par minuteDans un shaker thermostatique en conditions, digestion oscillante horizontale15 à 30Minutes, tous les temps10Minutes d'observation de la digestion des tissus, le bloc de tissu à disperser clairement, lorsque la suspension est plus trouble, prendre la quantité appropriée de tissu digestif suspension pour la scopie, il y a plus de masse de cellules vivantes dans la suspension peut mettre fin à la digestion, si le bloc de tissu est plus grand ou La digestion ne peut pas prolonger correctement le temps de digestion. Différentes spécifications peuvent être utilisées pendant la digestion (l'ordre varie de grand à petit comme10 mlEt,5 mlEt,1 ml), la pipette souffle la suspension Digestive des tissus pour aider à une digestion adéquate. Lorsque la plupart des fragments de tissus sont capables de passer1 mlLorsque la pipette aspire la tête, le processus de digestion est terminé.

7, SeraFBSAjouter au mélange de digestion tissulaire, la concentration finale étant2%Et utiliser100 μmFiltration des filtres cellulaires.

8, Recueillir le filtrat et4℃Inférieur à250gCentrifugation3Minutes. En cas de précipité rouge visible, aspirer le surnageant, ajouter2 mlPrécipité de resuspendation du lysat de globules rouges, lyse des globules rouges à température ambiante1Minutes et dans4℃Inférieur à250gCentrifugation3Minutes.

9, Aspiration du surnageant et remise en suspension du précipité dans le milieu de base des organoïdes épithéliaux, dans4℃Inférieur à250gCentrifugation3Minutes, répétez cette procédure à nouveau pour éliminer les sucs digestifs etFBS, la quantité appropriée de suspension est souhaitable pour la détection de l'activité cellulaire avant la centrifugation.

10, Aspirer le surnageant, prendre la bonne quantité de précipité cellulaire selon les besoins de culture ajouter la colle matricielle (> 70%), et mélanger sur la glace (Note: mélanger l'action de soufflage pour être doux, Cheeky produit beaucoup de bulles d'air, mélanger à température normale doit être contrôlé dans15Dans les secondes), après mélange sur la glace. Remarque: la colle de substrat doit être conservée sur de la glace pour éviter sa coagulation. Faites le processus le plus rapidement possible. Environ10000Les cellules doivent être inoculées dans25 μLDans la colle de matrice. Ne pas trop diluer la colle de matrice (la proportion de colle de matrice doit être> 70%(volume de colle de matrice/Volume total)), car cela peut inhiber la formation correcte de gouttelettes solides.

11, Pointer une suspension mixte de colle matricielle et de cellules dans le fond de la plaque de culture positive, en utilisant la tête du pistolet pour aplatir légèrement la suspension, en prenant soin d'éviter que la suspension ne touche les parois latérales de la plaque de culture. (recommandé:96Inoculation de plaque de trou3 à 10μL/Le trou,48Inoculation de plaque de trou10 à 20 μL/Le trou,24Inoculation de plaque de trou20 à 30 μL/Le trou).

Remarque: une fois que les organoïdes sont remis en suspension dans la colle matricielle, effectuez la germination dès que possible, car la colle matricielle peut se solidifier dans le tube à essai ou la tête d'aspiration de la pipette.

12, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans l'incubateur15 à 25Minutes, laissez le substrat gélifier.

13, Après gélification du substrat à gélifier, le milieu organoïde équilibré à température ambiante est ajouté lentement le long de la paroi pour éviter la destruction de la structure coagulée. (recommandé:96Plaque de trou rejoindre100 μL/Le trou,48Plaque de trou rejoindre250 μL/Le trou,24Plaque de trou rejoindre500 μL/Le trou). Remarque: n'ajoutez pas le milieu de culture directement sur le dessus des gouttelettes de gomme matricielle, car cela pourrait endommager la structure coagulée.

14, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans un incubateur à température constante.

15, Chaque fois2 ~ 3Changez le milieu une fois par jour, aspirez soigneusement le milieu des puits et ajoutez du milieu frais d'organoïde équilibré à température ambiante.

16, Surveiller de près l'état de croissance des organoïdes, idéalement, les organoïdes mammaires humains devraient être7 à 14Construit en jours.

b) Culture générationnelle d'organes épithéliaux de l'estomac humain

1, Les organoïdes à cultiver jusqu'à un diamètre de100 à 500 μmGrandes heures (ou lorsque le noircissement n'augmente plus), les passages organoïdes peuvent être effectués (environ par génération)1 ~ 2Semaines). Les consommables pour les opérations suivantes en contact avec les cellules doivent être utilisés après lavage avec une lotion lubrifiante:

2, Aspirer l'ancien milieu, ajouter un volume égal de milieu de base d'organoïdes épithéliaux, gratter doucement (ou souffler) la colle de matrice et le mélange d'organoïdes avec un racleur cellulaire ou une tête d'aspiration de pipette, transférer à1,5 mlDans des tubes centrifuges (collecte maximale par tube2 ~ 3Organoïdes poreux, éviter le volume excessif faible efficacité Digestive), soufflé5 à 10Secondaire, séparer les organoïdes et la colle stromale,300gCentrifugation3Minutes.

3, Enlever le surnageant ajouter5Volume de liquide digestif organoïde égal au volume du mélange de gomme matricielle et organoïde, après mélange par soufflage37℃Digestion en incubateur5 à 10Minutes. Retirer le mélange soufflé, prendre10 μLLa microscopie liquide mixte vérifie si elle est digérée en petits amas cellulaires, et une digestion inadéquate peut prolonger le temps de digestion de manière appropriée. Si vous avez besoin de compter les cellules, vous devez les digérer en cellules individuelles, ce qui peut prolonger le temps de digestion jusqu'à10 à 20La coloration au bleu Trypan postérieure à la digestion est terminée après minutes pour le comptage cellulaire. Une surveillance étroite du processus digestif permet une incubation minimale dans le liquide dissociatif organoïde.

4, Une fois la digestion terminée, ajouter5Volume multiple milieu de base des organoïdes épithéliaux brassé par soufflage pour mettre fin à la réaction digestive, puis250gCentrifugation3Minutes.

5, Aspiration du surnageant, lavage avec le milieu de base des organoïdes épithéliaux2Une fois pour enlever le suc digestif résiduel. Un lavage secondaire peut combiner les organoïdes et les collecter dans le même tube de centrifugation.

6, Les cellules du précipité centrifugé sont soumises à une culture de passage une fois le lavage terminé, la colle matricielle est ajoutée au précipité cellulaire (> 70%), et mélanger sur la glace (Notez que l'action de soufflage de mélange doit être douce, Cheeky produit beaucoup de bulles d'air, le mélange à température normale doit être contrôlé dans15Dans les secondes), après mélange sur la glace. Remarque: la proportion de dilution de la colle de matrice doit être70%Ci - dessus pour garantir la stabilité structurelle de la colle matricielle pendant la culture.

7, Pointer une suspension mixte de colle matricielle et de cellules dans le fond de la plaque de culture positive, en utilisant la tête du pistolet pour aplatir légèrement la suspension, en prenant soin d'éviter que la suspension ne touche les parois latérales de la plaque de culture. (recommandé:96Inoculation de plaque de trou3 à 10μL/Le trou,48Inoculation de plaque de trou10 à 20 μL/Le trou,24Inoculation de plaque de trou20 à 30 μL/Le trou). Remarque: pour éviter que la colle de matrice ne se solidifie à température ambiante, cette étape doit être effectuée dès que possible.

8, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans l'incubateur15 à 25Minutes, laissez le substrat gélifier.

9, Après gélification du substrat à gélifier, le milieu organoïde équilibré à température ambiante est ajouté lentement le long de la paroi pour éviter la destruction de la structure coagulée. (recommandé:96Plaque de trou rejoindre100 μL/Le trou,48Plaque de trou rejoindre250 μL/Le trou,24Plaque de trou rejoindre500 μL/Le trou). Remarque: n'ajoutez pas le milieu de culture directement sur le dessus des gouttelettes de gomme matricielle, car cela pourrait endommager la structure coagulée.

10, Placer la plaque de culture dans37℃et5 % de CO₂Dans un incubateur à température constante.

11, Chaque fois2 ~ 3Changez le milieu une fois par jour, aspirez soigneusement le milieu des puits et ajoutez du milieu frais d'organoïde équilibré à température ambiante.

12, Surveiller de près l'état de croissance des organoïdes jusqu'à ce que les organoïdes nécessitent la prochaine étape de l'expérience

V2.1Edition

Temps de mise à jour:20 / 06 / 2025