Ensemble de milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain d'organismes à base de moule

Kit organoïde intestin humain

Ensemble de milieu de culture d'organes de l'intestin grêle humain

1, Description du produit

Kit de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain à base de moule bio (Kit organoïde intestin humain), un kit de milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle pour l'établissement et le maintien d'une source de cellules souches adultes de l'intestin humain, ce kit fournit un ensemble complet de réactifs pour la séparation de la crypte de l'intestin grêle, la récupération de la crypte, l'analyse de l'activité de la crypte et la culture. L'activité de la crypte intestinale grêle peut être maintenue dans une plus grande mesure et le taux de formation des organoïdes de l'intestin grêle peut être amélioré, les organoïdes de l'intestin grêle humains cultivés se composent principalement de cellules souches de l'intestin grêle, de cellules à amplification rapide, de cellules absorbantes intestinales, de cellules de Pan, de cellules caliciformes et d'un petit nombre de cellules endocrines intestinales, en termes de capacité d'auto - renouvellement, de structure tissulaire, de types de cellules et de fonctions, les organoïdes de l'intestin grêle humain peuvent reproduire partiellement les caractéristiques de l'

2, Informations sur le produit

3, Autres matériaux et réactifs autonomes

4, Préparation du milieu de culture des organoïdes de l'intestin grêle humain

Formuler un milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain dans un plan de travail stérile ultra - net. Pour formuler10 mlLe milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain, par exemple, si la quantité requise est différente, la quantité peut être ajustée en conséquence.

1, Décongélation des facteurs de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain sur glaceB(50x), facteur de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humainC(250x), facteur de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humainD(250x)- Oui.

Remarque: Après décongélation, il est recommandé de cultiver des facteurs pour les organoïdes de l'intestin grêle humainB(50x)Facteurs de culture d'organes de l'intestin grêle humainC(250x). conserver pour l'utilisation après le chargement séparé, éviter la congélation et la dégel répétées.

2, Mélanger bien à l'envers Après décongélation du milieu à cultiver, dans une armoire de sécurité biologique ou un plan de travail propre selon les besoins quotidiens, sous - ensemble recommandé10 mL/Le tube.

3, Milieu de culture après le fractionnement s'il vous plaît stocker après scellé dans-20℃, retirer le milieu de culture fractionné lors de l'utilisation est prêt à être utilisé après avoir été placé à l'équilibre de la température ambiante.

Remarque: le milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain après formulation peut être2-8°CStockage, recommandé dans les deux semaines. En outre, le facteur de culture des organoïdes de l'intestin grêle humainB(50x)Contient des antibiotiques bactériens et fongiques(50x)- Oui.

5, Établissement et culture de passage d'organoïdes de l'intestin grêle humain

Remarque: les études impliquant des matériaux de tissus humains primaires doivent suivre toutes les réglementations institutionnelles et gouvernementales pertinentes. Le consentement éclairé de tous les sujets doit être obtenu avant la collecte des principaux tissus humains.

a) Établissement des organoïdes primaires de l'intestin grêle

1, Échantillonnage: le tissu primaire de l'intestin grêle humain est recueilli dans un liquide protecteur de tissu primaire glacé à l'aide d'un tube à centrifuger, l'échantillon de tissu étant conservé dans4°CJusqu'à ce que la séparation commence.

2, Lavage: transférer l'échantillon de tissu chargé de pré - refroidissementDPBSDans la boîte de pétri du tampon, la cavité intestinale face vers le haut, une main en utilisant une extrémité de tissu intestinal pincé, l'autre main en utilisant une feuille pour gratter doucement le villosités intestinales à la surface de la cavité intestinale, à gratter le villosités intestinales après avoir été nettoyé, le tissu intestinal est placé dans Un nouveau contenantDPBSLaver dans une boîte de pétri, répéter le nettoyage2Une fois. Briser l'intestin grêle lavé à2 mmLarge, transféré dans une nouvelle boîte de pétri, avecDPBSNettoyage2Partout.

3, Digestion: transférer les segments intestinaux lavés à ceux qui contiennentEDTA de 5mM/LLe pré - refroidissementDPBSMoyenne digestion, placée dans4℃Ou incubation dans la glace pilée20 à 30 minutes, digestion20 minutesLa pipette gauche et droite peut souffler doucement sur le segment intestinal, prendre un microscope de nettoyage pour observer, à nettoyer pour apparaître une crypte complète peut terminer la digestion, si aucune crypte peut prolonger le temps de digestion appropriée.

4, Lavage: une fois la digestion terminée, transférer les fragments de tissus à un nouveau contenantDPBSLaver dans une boîte de pétri, répéter2Une fois pour enleverEDTA- Oui.

5, Resurfaçage: avec5 mlPipette en pré - refroidissement0,1 % de BSAdeDPBSBoîtes de pétri ou50 mlSouffler, remettre en suspension des fragments de tissu dans le tube de centrifugation, de sorte que le tissu traverse à plusieurs reprises la pointe de la pipette pour créer une force de cisaillement mécanique afin de séparer la crypte de la couche de base, prendre une partie de la microscopie de la suspension, lorsque vous pouvez voir un grand nombre de structures ressemblant à des cryptes, arrêter le soufflage et effectuer une suspension de tissu après le soufflage70 μmFiltration du filtre.

6, Collecte: collecte de la suspension tissulaire portant le filet filtrant,300gForce centrifuge4℃Centrifugation3 minutes- Oui.

7, Compter: jeter, utiliser1mL0,1% BSAdeDPBSResuspendre précipitation des tissus, prendre20 μLLa suspension est soumise à une microscopie et à un comptage des cryptes, le comptage étant terminé par aspiration de la suspension contenant la quantité de cryptes souhaitée,300gForce centrifuge4℃Centrifugation3 minutesDéposer sur la glace.

8, Précipitation des tissus avec une quantité appropriée de colle matricielle, la densité de resurfaçage recommandée est de chaque10 μLLa suspension de colle matricielle contient70à100Un Ermitage, placé sur la glace après le resurfaçage, le resurfaçage ne dépasse pas30 ansPour éviter une coagulation prématurée du gel de matrice.

Remarque: la proportion de dilution de la colle de matrice doit être70%Ci - dessus pour garantir la stabilité structurelle de la colle matricielle pendant la culture.

9, Spot une suspension mixte de colle matricielle et de cellules tissulaires dans24Fond de plaque de trou positif, par trou30μLGauche et droite, évitez que la suspension touche les parois latérales de la plaque d'orifice..10.Plaque de culture après la fin de l'inoculation quant à37℃Dans un incubateur thermostaté au dioxyde de carbone, incubé30 minutesGauche et droite à gélifier le substrat.

10, Après gélification du substrat à gélifier, le milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain déjà formulé est ajouté lentement le long de la paroi,24Plaque de trou par trou500 μLéviter la destruction des structures solidifiées.

11, Sera24Plaque de trou placée37℃Culture en incubateur CO2.

12, Chaque2 ~ 3Changez le milieu une fois par jour et évitez de détruire la colle de matrice lors du changement de milieu. Surveiller de près l'état de croissance des organoïdes, idéalement, les organoïdes de l'intestin grêle humain devraient être5à7Construit en jours.

b) Culture de passage d'organoïdes de l'intestin grêle humain

1, Culture d'organes de l'intestin grêle humain jusqu'à un diamètre de200 à 500μmGrande heure (ou lorsque le noircissement n'augmente plus), le passage des organoïdes de l'intestin grêle humain peut être effectué (environ par génération)5Jours environ). Prélever les organoïdes par soufflage à l'aide d'une tête de pistolet lavée avec une lotion lubrifiante et transférer la suspension d'organoïdes et de milieu de culture de l'intestin grêle à ceux qui ont été lavés avec une lotion lubrifiante1,5mLEPDans le tube.

2, Souffler vigoureusement la suspension d'organoïdes en suspension avec une tête de pistolet lavée avec une lotion lubrifiante, souffler plusieurs fois (5 à 10Secondaire) faire souffler les organoïdes de l'intestin grêle séparément de la colle matricielle,300gCentrifugation3 minutes- Oui.

3, Abandonner, rejoindre1 mlMilieu de base soufflant à nouveau les organoïdes5 à 10Une fois, prenez une petite quantité de suspension pour observer l'état organoïde:

1) Si les organoïdes ont été dispersés en morceaux, vous pouvez choisir de souffler mécaniquement les organoïdes dispersés directement après300gCentrifugation3 minutesAprès centrifugationPBSOu nettoyage du milieu de base2Une fois.

2) Si les organes sont relativement complets300gCentrifugation3 minutesAprès, abandonner, rejoindre5Liquide digestif organoïde double du volume du mélange de gomme matricielle et d'organoïdes de l'intestin grêle humain, après mélange par soufflage37℃Digestion en incubateur2 minutes. adhérer5Un volume de milieu de base égal à celui du suc digestif termine la digestion. Utiliser après centrifugationPBSOu nettoyage du milieu de base2Une fois.

4, Précipité organoïde après nettoyage avec une quantité appropriée de colle de matrice, après remise en suspension sur la glace, le temps de remise en suspension ne dépasse pas30 ansPour éviter une coagulation prématurée du gel de matrice.

Remarque: la proportion de dilution de la colle de matrice doit être70%Ci - dessus pour garantir la stabilité structurelle de la colle matricielle pendant la culture.

5, Spot suspension mixte de colle matricielle et organoïdes dans24Fond de la plaque d'orifice positif, éviter que la suspension touche la paroi latérale de la plaque d'orifice, chaque trou30μL左右。

Remarque: pour éviter que la colle de matrice ne se solidifie à température ambiante, cette étape doit être effectuée dès que possible.

6, Plaque de culture après la fin de l'inoculation quant à37℃Dans un incubateur thermostaté au dioxyde de carbone, incubé15 minutesGauche et droite à retirer après gélification du substrat.

7, Formuler un milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain.

8, Après gélification du substrat à gélifier, on ajoute le milieu de culture d'organoïdes de l'intestin grêle humain préchauffé au préalable le long de la paroi du puits,24Plaque de trou par trou500 μL- Oui.

9, Placer la plaque de culture cellulaire dans37℃La culture est effectuée en incubateur, en observant de près l'état de croissance des organoïdes de l'intestin grêle humain, chaque3Tian a pris des photos sous un microscope inversé pour enregistrer la morphologie et la distribution des organoïdes de l'intestin grêle humain dans plusieurs champs de vision.

V2.0Edition

Temps de mise à jour:2025 / 6 / 17