Pblue - t kit de clonage de vecteur T4 principe vecteur et autres

NoboladePblue - t kit de clonage de vecteur T4 principe vecteur et autres

Kit de clonage de vecteur pblue - t

Numéro de catalogue: 42014

Composition du kit, stockage, stabilité:

- 20 ℃ stockage, 6 mois n'affecte pas l'efficacité de l'utilisation.

Les paramètres du produit spécifique sont soumis aux paramètres de la description du produit reçu

Introduction du produit:

De nombreuses ADN polymérases à haute température, telles que Taq DNA polymérase, Tth DNA polymérase et autres produits de PCR amplifiés en 3 '-Les extrémités portent toutes une base a proéminente, un tel produit PCR peut être utilisé avec 3 '-Le vecteur portant une base saillante t après l'extrémité est commodément cloné. Le vecteur pblue - t est dérivé du plasmide pbluescript II SK (+) avec l'ajout de la séquence appropriée au site de coupure de l'enzyme ecori, résultant de la production directe d'une base t non appariée à son extrémité 3 'après coupure par l'enzyme xcm I, et donc d'une plus grande efficacité de recombinaison. Deux sites ecor I conçus de manière unique aux deux extrémités du site d'insertion du vecteur pblue - t permettent de détecter le fragment d'insertion par un clivage monoenzymatique ecor I peu coûteux et efficace; Le vecteur pblue - t simultané, dépourvu de sites endonucléase de restriction ndei ou ncoi, peut être aisément utilisé pour le clonage de gènes contenant les sites de clivage enzymatique précités. En outre, le système de connexion de vecteur de la société a des caractéristiques telles que le faible fond (moins de 10% de points bleus), le taux de recombinaison élevé (plus de 90% des points blancs ont des fragments insérés), peut être rapidement connecté. Les informations techniques relatives au vecteur pblue - t dont la séquence complète peut être référencée par référence à la séquence pbluescript II SK (+) sont listées à la fin de la description, à l'exception de sa séquence légèrement différente au site de coupure de l'enzyme polyclonale.

Le séquençage peut prendre des amorces de promoteur T3, T7 et des amorces de séquençage génériques M13 (voir carte ci - dessous)

Étapes opérationnelles:

1. Préparation de la réaction de connexion:

Que le produit PCR soit purifié ou non dépend de la qualité du produit amplifié. Si le produit PCR est très propre, la réaction de ligation peut être effectuée directement sans purification. Mais s'il s'agit d'un produit PCR dont le plasmide modèle est susceptible de former également des taches blanches, la purification doit être effectuée. PCRLe produit peut être séparé par électrophorèse sur gel d'agarose. Kits de récupération de purification rapide de produits d'ADN fabriqués par cette société pour 7Les fragments d'ADN supérieurs à 0 pb sont bien récupérés.

Produits PCR amplifiés par la Taq, Tth, amplitaq, klentaq DNA polymérase, tous portant une protubérance 3 'à leurs extrémités-A- Oui. Avec3 '-Le produit de PCR en extrémité a - terminale peut être directement lié par clonage avec le vecteur pblue - t. Avec 3 '®Le produit PCR amplifié par l'ADN polymérase (enzyme de haute fidélité) de l'activité de l'Exonucléase 5 'est à extrémité plate, pour cloner ce produit PCR à extrémité plate doit être excellente ligne 3'-End plus a fonctionne.

2. Réaction de connexion conventionnelle:

1) dans un standard de 10mL connecter le système réactionnel, ajouter 1ml30% de pblue - tLe porteur, Xml PCRProduits (dans les conditions habituelles, il n'est pas nécessaire dela PCRLe produit est quantifié avec précision, le rapport molaire général du produit PCR au support est optimisé à 2: 1 ~ 10: 1 pour obtenir de bons résultats, 3: 1 recommandé),1ml 10»tampon ligationEt 0,5 - 1ml(2.5-5 Weiss Units) pour l'ADN T4Ligase， Le reste est complété avec de l'eau. La réaction s'effectue selon le système suivant:

L'ADN T4 ligase est généralement ajouté en dernier.

2) connexion de 16 ℃ pendant la nuit (généralement peut être fait dans l'instrument PCR).

Habituellement recommandé 16 ℃ connexion pour la nuit (10mlLa quantité de ligase standard du système est de 2,5unités WeissC'est - à - dire), on peut obtenir le plus grand nombre de transformants. Mais ce système avec PEG Enhancer peut augmenter l'efficacité de la connexion plusieurs fois，En cas de quantités élevées de ligase (10mlLa quantité de ligase recommandée par le système est de 5unités Weiss) connexion 16 ℃ pendant 30 minutes, c'est - à - dire jusqu'aux exigences de l'étude générale.

3)Refroidissement sur glace puis transformation ou stockage à - 20°C.

3. Réaction de connexion rapide:

1) La réaction est effectuée selon le système suivant:

L'ADN T4 ligase est généralement ajouté en dernier.

2) 22 ℃ connexion 5 - 10 minutes (généralement peut être fait dans l'instrument PCR).

2 »Quick ligation buffer contient déjà tous les composants de connexion rapide optimisés et recommande généralement une connexion à 22 ° C pendant 10 minutes.(10mlLa quantité de ligase systémique est de 5unités WeissLes ligatures de segments longs peuvent être prolongées jusqu'à 30 minutes) peuvent généralement donner des résultats satisfaisants. En outre, ce système peut également être connecté à 16 ℃ pendant 30 minutes (10mlLa quantité de ligase systémique est de 5Weiss Units), c'est - à - dire jusqu'aux exigences de la recherche générale.

3)Refroidissement sur glace puis transformation ou stockage à - 20°C.

4. Transformation:

ð50 à 100mL cellules réceptrices, placées sur la glace, après la décongélation Quan, légèrement dépouillées plusieurs fois pour mettre les cellules en suspension uniformément.

ðAdhésion 4 - 5mlLiquide de ligature (tout au plus peut être ajouté, à condition que le volume ne dépasse pas 1 / 10 du volume des cellules réceptrices), mélanger doucement. Placement sur la glace30 minutes. 42℃ bain d'eau chaud 90Secondes. Placement sur glace 2~ 3 minutes.

ðAjouter 500mL de milieu LB ou SOC (sans antibiotiques), 37 °C 150 tr / minIncuber sous agitation pendant 60 minutes.

DansSera 200mlApplication bactérienne au préalable 16ml 50mg/ml IPTGEt 40mL 20 mg / ML X - gal enduit sur une plaque d'Ampicilline - Qing - mycine.

La quantité de bactéries enduites est ajustée de manière appropriée en fonction de l'efficacité de la connexion et du taux de sensibilité des cellules réceptrices, si moins de clones sont attendus, une partie du liquide de culture peut être aspirée après centrifugation (4000 RPM, 2 minutes), laissant une quantité appropriée de milieu de culture en suspension et tout ou une quantité appropriée de bactéries enduites dans une plaque (le liquide restant enduit peut être conservé à 4 degrés, le jour 2 Si le nombre de colonies transformées est faible, le liquide restant peut être enduit d'une nouvelle plaque).

ðLes plaques sont placées en avant à 37°c pendant 1 heure pour absorber l'excès de liquide, puis incubées à l'envers pendant une nuit.
5 filtre:

1). Criblage bleu - blanc des transformants:

Lorsqu'un fragment d'ADN exogène est inséré dans pblue - tAprès le milieu, en raison de sources externesLa présence de la séquence d'acide nucléique de l'ADN modifie le codage du gène lacZ, ce qui affecte ses produitsb-Galactosidasea-L'activité du fragment, donc des clones Recombinants, apparaît en blanc sur la plaque X - gal / IPTG, alors que les clones non Recombinants apparaissent en bleu. ParfoisInsérer un fragment n'a aucun effetLe cadre de lecture du gène lacZ, ou le fragment inséré est trop petit, auquel cas la colonie (clone recombinant) présente une couleur bleu pâle ou une tache bleu pâle au centre de la colonie, avec un anneau extérieur blanc (fisheye Blue spot fish eye). Sélectionnez des colonies blanches ou bleues pâles cultivées sur des plaques IPTG / X - gal, sélectionnez - les avec un cure - dents sur un milieu liquide contenant de l'ampicilline qingmycine et incuber à 37 ° C pendant une nuit.
2). Identification des transformants:

a.Les plasmides ont été extraits avec les fluides bactériens des colonies blanches cultivées ci - dessus, coupés avec la monoenzyme ecor I ou avec d'autres enzymes appropriées, et la taille des fragments a été vérifiée par électrophorèse sur gel d'agarose pour déterminer s'ils contenaient le fragment d'intérêt.

b.Sélection de colonies blanches pour détection PCR directe (voir Molecular Cloning version 3 ou nous consulter)

C. séquençage avec des amorces promotrices T3 et T7 ou d'autres amorces appropriées pour déterminer si elles contiennent des clones cibles.

Comment calculer la quantité de produit PCR nécessaire dans la réaction de ligation?

Le rapport molaire du produit de PCR général au support optimisé à 2: 1 ~ 10: 1 (3: 1 recommandé) peut obtenir de bons résultats, la formule suivante peut être utilisée:

[quantité de vecteur ajouté (ng) × taille du fragment inséré (KB) ÷ taille du vecteur (KB)] × rapport molaire du fragment inséré et du vecteur = quantité du fragment inséré (ng) par exemple: le rapport molaire entre le fragment inséré et la jonction du vecteur est de 3: 1, comme dans La réaction de ligation, le vecteur est ajouté 40 Ng et la taille du fragment inséré est de 1000 pb, la quantité de fragment inséré qui devrait être ajoutée est [40 ng de vecteur × 1 KB de fragment inséré ÷ 2.984 KB de vecteur] × 3 / 1 = 40.2 ng.

Pblue - t kit de clonage de vecteur T4 principe vecteur et autres