Universel SYBR Green qPCR Mix

Conditions de stockage et de transport

S'il vous plaît garder à l'abri de la lumière à - 20 ℃, après la fusion mix peut être stocké de manière stable à l'abri de la lumière à 4 ℃ pendant un mois, essayez d'éviter le gel et la dégel répétés.

Composants du produit

Universel SYBR Green qPCR Mix

Présentation du produit

Universel SYBR Green qPCR MixC'est sybr ® Les réactifs QPCR spécifiques à la méthode de colorant chimérique Green I, qui sont des prémélanges 2x contenant tous les composants QPCR à l'exception des amorces et des échantillons d'ADN, réduisent les étapes opératoires, réduisent le temps d'addition et réduisent les risques de contamination. Son composant principal est l'ADN polymérase Taq modifié par des anticorps, associé à un système buffer soigneusement optimisé ainsi qu'à un facteur de facilitation de la réaction PCR, ce qui permet au produit d'avoir une forte spécificité, une efficacité d'amplification élevée, une inhibition efficace de l'amplification non spécifique, une large gamme de concentrations de matrice peut être évaluée avec précision pour obtenir des résultats QPCR stables et fiables. Le prémélange contient un colorant correcteur universel, compatible avec la grande majorité des appareils QPCR, y compris les instruments nécessitant une correction Rox, et aucun colorant correcteur supplémentaire n'est généralement nécessaire au cours de l'expérience.

mode d'emploi

1. Attention à l'utilisation

① en raison du prémélange de colorants dans Mix, leur conservation ou le processus de formulation du système réactionnel doit éviter l'exposition à la lumière forte;

② mélanger doucement Mix à l'envers avant utilisation, ne pas agiter le mélange, éviter de créer trop de bulles;

③ mix contient un colorant correcteur universel pour tous les modèles sans ajout de colorant supplémentaire.

Système de réaction QPCR recommandé

A. la concentration finale d'amorce généralement recommandée est de 0,2 μm, qui peut être ajustée dans la gamme 0,1 ~ 1 μm lorsque l'effet de la réaction est faible;

B. La quantité recommandée d'échantillon de coffrage est de 1 ~ 2 μl, si le type de coffrage est du liquide brut d'adnc non dilué, la quantité ajoutée de coffrage ne doit pas dépasser 10% du système réactionnel total. Le nombre de copies du gène cible contenu dans les différents types de matrices d'ADN varie et des dilutions graduées peuvent être effectuées si nécessaire pour déterminer la quantité optimale de matrices d'ADN à ajouter.

3. Procédure de réaction QPCR (peut être adaptée en fonction du modèle)Universel SYBR Green qPCR Mix

Méthode en deux étapes

Méthode en trois étapes

A. réglage de la température de recuit et d'extension (recuit) en fonction de la valeur TM de l'amorce; Si le fragment amplifié est inférieur à 200 pb, le temps de recuit et d'extension peut être fixé à 15 sec; En outre, le réglage du temps de recuit et d'extension doit également être ajusté en fonction du temps d'acquisition de données minimum requis par le QPCR que vous utilisez;

B. Il existe des différences dans la procédure d'acquisition de la courbe de fusion de différents instruments QPCR, généralement la procédure d'acquisition de la courbe de fusion par défaut de l'instrument peut être utilisée.

4. Optimisation expérimentale

Si les performances de la réaction ne sont pas bonnes en utilisant les conditions de réaction par défaut, l'optimisation des conditions de réaction est nécessaire et peut être effectuée à partir de la concentration des amorces ainsi que de la procédure d'amplification:

① ajustement de la concentration des amorces

Lorsque la concentration finale d'amorce varie entre 0,1 ~ 1,0 μm, plus la concentration d'amorce est faible, plus la spécificité de l'amplification est élevée, mais l'efficacité de l'amplification diminuera.

② optimisation du Programme d'amplification

Il est nécessaire d'améliorer la spécificité d'amplification, soit en utilisant une procédure en deux étapes, soit en augmentant la température de recuit; Pour améliorer l'efficacité de l'amplification, il est possible d'utiliser une procédure en trois étapes ou de prolonger la durée d'extension.

5. Principes de conception des amorces

① longueur de produit d'amplification recommandée contrôlée à 80 ~ 200 pb;

② longueur de l'amorce est de 18 ~ 25 BP;

③ la différence entre les valeurs TM des amorces avant et arrière ne dépasse pas 1 ℃ est bonne, la valeur TM est contrôlée à 58 ~ 62 ℃ est bonne;

La teneur en GC des amorces ④ est contrôlée entre 40% ~ 60%;

⑤ la distribution globale des amorces a, G, C, T doit être aussi uniforme que possible, en évitant la structure continue de t / C ou A / G (en particulier l'extrémité 3 ');

⑥ la dernière base à l'extrémité 3 'de l'amorce est de préférence g ou C;

⑦ éviter les séquences complémentaires à l'intérieur des amorces ou entre deux amorces;

⑧ la spécificité des amorces de confirmation est récupérée à l'aide de la fonction NCBI Blast.

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