T - Vector Colony PCR Identification Kit T4 principe vecteur

NoboladeT - Vector Colony PCR Identification Kit T4 principe vecteur

Kit universel d'identification PCR des colonies de vecteurs t

Numéro de catalogue:42015

Composition du kit, stockage, stabilité:

Stockage: - 20 ° C de conservation.

Les paramètres du produit spécifique sont soumis aux paramètres de la description du produit reçu

Introduction du produit:

L'identification par PCR des colonies est la méthode la plus rapide Bian pour déterminer s'il existe des clones positifs (contenant des fragments d'insertion) après ligation des clones de vecteurs T. Cependant, les kits d'identification PCR des colonies disponibles sur le marché utilisent des amorces de vecteur t spécifiques telles que T3, T7 ou sp6, qui ne peuvent être utilisées que pour l'identification de clones positifs liés à un vecteur t spécifique. Si vous utilisez différents transporteurs T, vous devrez acheter plusieurs kits de qualification en même temps, ce qui augmente considérablement le coût d'utilisation. Le kit d'identification PCR de colonie de vecteur t universel développé par la société à l'aide d'amorces de vecteur t universel peut être utilisé pour l'identification des clones positifs liés à tous les vecteurs t courants disponibles sur le marché, y compris les séries pgem, PUC et pbluescript. De plus, les amorces du kit d'identification PCR des colonies utilisant T3, T7 ou sp6 comme amorces sont à très courte distance du site d'insertion, de sorte que les bandes dimères d'amorces et les bandes d'amplification de clones positifs pour les clones négatifs sont de tailles proches et ne peuvent pas être distinguées lors de l'identification de l'insertion de fragments d'environ 100 pb ou moins. Souvent, les bandes de dimères d'amorce sont considérées comme des bandes d'amplification positives, ce qui entraîne des faux positifs. Au contraire, provoquer un faux négatif. Les amorces de vecteur t universel de ce kit sont distantes d'au moins 150 pb ou plus lorsqu'elles ne sont pas insérées dans le fragment, ce qui, ajouté à la longueur du fragment inséré, permet de distinguer clairement si c'est la bande amplifiée par le fragment inséré ou la bande amplifiée par le dimère d'amorce. Éviter les faux positifs ou les faux négatifs améliore considérablement la précision.Notre société a développé un tube portable PCR mastermix système de prémélange, vous n'avez pas besoin d'ajouter une variété d'ingrédients un par un, ajouter directement à la nécessité de filtrer les colonies uniques, après environ 1 heure de réaction PCR et de détection électrophorétique peut obtenir le résultat de l'identification des colonies recombinantes.

Fragments amplifiés attendus:

Précautions:

1. Lors de l'identification des colonies recombinantes, avant de sélectionner une seule colonie, il convient de bien marquer, ce qui facilite l'utilisation après l'identification.

2. Lorsque vous sélectionnez des colonies, vous devez choisir une seule colonie et ne pas sélectionner trop de colonies pour ne pas affecter les résultats de la PCR.

3. Lorsque vous configurez le programme PCR, décidez du temps d'extension en fonction de la taille du fragment inséré, si la taille du fragment inséré est inférieure à 1 KB, le temps d'extension est de 30 à 45 secondes, si le fragment est plus long, vous pouvez augmenter le temps d'extension dans cette proportion.

Étapes opérationnelles (à 25mlExemple de système, les clients peuvent également utiliser 20mlSystème):

1. 1 X du réactif Taq mastermix contenant les amorces sont dosés selon le système suivant.

2.Après numérotation des colonies sur les plaques cultivées pendant la nuit, une partie des colonies individuelles est ajoutée au liquide réactionnel ci - dessus à l'aide d'une tête de pistolet stérilisée, le mélange par soufflage permettant une dispersion adéquate des colonies dans le liquide réactionnel.

Un tube supplémentaire de contrôle négatif sans colonie peut être réglé pour faciliter l'analyse des résultats expérimentaux.

3.Placer le tube PCR sur le thermocycleur pour commencer la réaction dans les conditions suivantes, les conditions recommandées sont les suivantes:

94 ℃ 10 minutes

94℃ 30 secondes

55℃ 30 sec 30-33 cycles

72 ℃ 0,5-1 min

72 ℃ 5 minutes

Remarque: Veuillez ajuster la durée d'extension en fonction de la taille du fragment inséré. Le temps de pré - dénaturation a été prolongé à 10 minutes, principalement pour lyser les colonies et libérer les modèles d'ADN.

Après la fin de la réaction, prendre 5 - 10mL détection par électrophorèse directe.

Remarque: si la bactérie est difficile à lyser ou si les impuretés sont Multi - faux négatifs, essayez la méthode ci - dessous et lyser l'ADN après l'avoir libéré.

1. Pick colonies ajouter 50mL DD eau (ou 10mL DD eau), vibration.

2. 99 degrés, 10 minutes inactive les enzymes dans le liquide bactérien et libère l'ADN.

3. La centrifugation à 12000 RPM pendant 1 minute élimine les débris cellulaires.

4. Retrait PCR, 25mL système PCR prend 5mL clearing (départ 50mL DD eau), ou 1mL clearing (début 10mL DD Water) pour le modèle.

T - Vector Colony PCR Identification Kit T4 principe vecteur