Kit de test génétique double fluorescéinase Report

Kit d'essai Firefly & Renilla (Kit de test génétique double fluorescéinase Report) fournit un moyen efficace de détecter la quantité d'expression d'un gène et, dans le test DLR, l'activité de la luciférase de Firefly et de la luciférase de rein marin (renilla luciferase) peut être détectée séquentiellement dans un seul échantillon. Tout d'abord, la Luciférine comme substrat pour détecter l'activité de la luciférase de Luciférine, puis ajouter des substances qui inhibent la catalyse de la luciférase de Luciférine, tout en ajoutant de la coelenterazine pour détecter l'activité de la luciférase du rein marin, réaliser un test de gène Rapporteur de la luciférase double. Grâce à la luciférase et à son substrat, le système de bioluminescence, l'expression des gènes peut être détectée de manière très sensible et efficace. Il est courant de cloner l'élément régulateur transcriptionnel ou la région promotrice 5 'du gène d'intérêt en amont de luciferase, ou la région 3' - utr en aval de luciferase, de construire un plasmide reporter - Gene, puis de transfecter les cellules, de traiter les cellules post - lysées avec des médicaments appropriés, etc., Pour déterminer l'effet régulateur transcriptionnel du traitement médicamenteux sur le gène cible en détectant les hauts et les bas de l'activité luciférase. La fluorescéinase rénale marine est plus utilisée comme Ginseng interne pour détecter l'efficacité de la transfection afin d'éliminer les différences dans le nombre de cellules et l'efficacité de la transfection.
La luciférase de Firefly est une protéine d'un poids moléculaire d'environ 61 KD qui, en présence d'ATP, d'ions magnésium et d'oxygène, catalyse la fluorescéine pour produire de la fluorescéine oxydée (oxyluciferine), qui produit un signal lumineux pendant l'oxydation de la fluorescéine. La fluorescéinase du rein marin est une protéine d'un poids moléculaire d'environ 36 KD qui, en présence d'oxygène, catalyse l'oxydation de la coelétine en entéramide (coelenteramide), qui produit également un signal lumineux lors de l'oxydation de la coelétine. Le signal lumineux de ce kit peut être déterminé au moyen d'un chimiluminescent, d'un étalon enzymatique ou d'un flashmètre liquide. Le kit est caractérisé par une détection rapide, une sensibilité élevée, une large gamme de détection et aucune perturbation de l'activité intracellulaire.
Caractéristiques du produit:
Rapide: la lyse cellulaire est terminée en 10 - 15 minutes.
Pratique: les réactifs sont faciles à formuler et les étapes de détection des échantillons sont simples.
Sensible: capable de détecter zui Low 10-20Mol de luciférase.
La concentration de l'enzyme peut varier linéairement jusqu'à 8 ordres de grandeur.
Composants du produit:

1, lyse cellulaire
(1) le milieu est retiré et lavé doucement deux fois avec du PBS (les cellules collées peuvent effectuer cette opération directement, les cellules en suspension doivent être centrifugées pour collecter les cellules). Ajouter 1 x lysis buffer (diluer le composant a 4: 1 avec de l'eau stérile) comme suit, puis placer la plaque de culture sur un micro - oscillateur à température ambiante pendant 15 min pour lyser adéquatement les cellules.
Remarque: les produits de craquage peuvent être conservés à température ambiante pendant 6 h, - 70 ° C pendant une longue période (les produits de craquage ne peuvent pas être congelés et dégelés à plusieurs reprises).
(2) Le produit de lyse est centrifugé à 10 000 - 15 000 tr / min pendant 3 - 5 min, après quoi le surnageant est transféré dans un nouveau tube EP pour une détection ultérieure.
Remarque: les cellules peuvent être détectées immédiatement après la lyse, elles peuvent également être congelées et redétectées si nécessaire. Les échantillons congelés doivent être fondus à température ambiante avant d'être détectés.
2, formulation de liquide de travail
(1) ramener tous les composants à température ambiante.
(2) dissoudre suffisamment le composant C avec le composant B pour former un liquide de travail luciférase de luciole à 0,2 mg / ML.
Remarque: le liquide de travail luciférase de Firefly ne peut pas être congelé et dégelé à plusieurs reprises, si une seule expérience est moins utilisée, il est recommandé d'utiliser des portions selon une seule utilisation dans de petites spécifications.
(3) diluer le composant e dans le liquide de travail luciférase du rein marin avec le composant d en ajoutant 1 µl de composant e à 49 µl de composant D.
Remarque: le fluide de travail de fluorescéinase rénale marine doit être utilisé actuellement.
3, détection de valeur de Luminescence chimique
(1) Suivez les instructions d'utilisation de l'instrument pour allumer l'instrument avec la fonction de détection de chimiluminescence, telle que l'étalon enzymatique multifonctionnel, régler les paramètres, le temps de dosage est de 10 s, l'intervalle de dosage est de 2 S.
(2) pour chaque essai d'échantillon, prenez l'échantillon 20 - 100 µl (si la quantité d'échantillon est suffisante, ajoutez 100 µl; si la quantité d'échantillon est insuffisante, la quantité appropriée peut être réduite, mais la quantité de trou d'essai doit être cohérente). 1 × lysis buffer est un témoin vierge.
(3) ajouter 100 UL de luciférase luciférase liquide de test pour déterminer la valeur rlu (relative Light Unit) (recommandé pour l'étalonnage enzymatique pour définir la fonction de mélange Shaking).
Remarque: Comme cette Luminescence est instantanée, il est recommandé de la détecter immédiatement après avoir ajouté le liquide de travail luciférase de Firefly.
(4) ajouter 100 UL de liquide de travail de fluorescéinase de rein marin pour déterminer la valeur rlu (relative Light Unit) (recommandé pour la fonction de mélange Shaking).
(5) dans le cas de la fluorescéinase du rein marin comme Ginseng interne, la valeur rlu obtenue par dosage de la fluorescéinase du rein marin est divisée par la valeur rlu obtenue par dosage de la fluorescéinase du rein marin. Le degré d'activation du gène Rapporteur pour différents échantillons a été comparé en fonction du rapport obtenu. Un calcul similaire peut être effectué si la luciférase de Firefly est utilisée comme Ginseng interne.

- 20 ° C de conservation. Le composant c est recommandé d'utiliser au préalable de l'eau stérile configurée pour un réservoir de 2 mg / ML, le composant B, le composant d et le composant C configuré comme réservoir,
Petites quantités de montage fractionné selon les besoins expérimentaux. Tous les fluides de travail de détection sont recommandés pour une utilisation actuelle et évitent la congélation et la dégel répétées.

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