Kit d'essai CHIP (magnétique)

RéférencePour:CH1581/CF1581/CM1581/CG1581

Conditions de stockagePour:Conservation à 4ºc

Description du produit

Les kits de détection Chip sont des kits pour la précipitation de fragments de chromatine liés à la protéine cible par immunoprécipitation et enfin des kits pour la détection de fragments de chromatine précipités par des méthodes telles que la PCR ou Southern. Il est généralement utilisé pour détecter si une protéine de liaison à l'ADN génomique telle qu'un facteur de transcription ou une Histone spécifique est dans le même complexe que la séquence d'ADN génomique spécifique attendue. La détection par Chip permet de conclure si la protéine cible in vivo et le fragment d'ADN génomique attendu sont dans le même complexe. Les résultats du test Chip indiquent clairement que cette liaison se produit réellement dans la cellule.

BenLe kit de test Chip utilise ha / dykddddk / myc / GFP - nanoab - Magnetic Beads comme perles de Chip pull - down, avec une force de jonction élevée de charge forte et des caractéristiques de gain de temps et d'efficacité. Le kit fournit des amorces de contrôle prémélangées (Control primers) qui peuvent être utilisées pour amplifier une partie de la séquence correspondante de GAPDH humaine, la séquence d'amorce étant: 5 '- tactagcggttttacgggcg - 3'; 5’-TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA-3’。

Étapes de fonctionnement (pour information seulement):

I. optimisation des conditions de Sonication des échantillons:

1. Préparez la bonne quantité de PBS pré - refroidi, ainsi que 100mm PMSF. Faites bien dissoudre le SDS dans le bain de lysis buffer correctement chaud et mélangez.

2. Les cellules sont cultivées dans des boîtes de culture de cellules de 250px avec une quantité de 10 ml de solution de culture de cellules. Ajoutez la bonne quantité de formaldéhyde directement à la solution de culture de cellules au moment où la liaison de la protéine d'intérêt et de l'ADN génomique est prévue, mélangez doucement jusqu'à ce que la concentration finale soit de 1%. Ensuite, incuber à 37 ° C pendant 10 minutes pour réticuler la protéine d'intérêt et l'ADN génomique correspondant. Exemple: 270 µl de formaldéhyde à 37% sont nécessaires pour ajouter 10 ml de solution de culture cellulaire dans une boîte de culture cellulaire de 250 Px. S'il vous plaît prendre soin d'essayer d'utiliser le formaldéhyde de haute qualité, la durée d'utilisation efficace. Les cellules peuvent également être cultivées dans des boîtes de culture de cellules de 150 Px, la quantité de solution associée devant être ajustée proportionnellement.

Ajouter 1,1 ml de solution Glycine (10x) et mélanger doucement. Laisser reposer 5 minutes à température ambiante.

4. Placez la boîte de pétri avec l'échantillon cellulaire sur un bain de glace. Aspirer le liquide de culture contenant du formaldéhyde et de la Glycine, en essayant de ne pas laisser de résidus liquides.

5. Laisser à température ambiante pendant 5 minutes, pendant lesquelles 100 mm PMSF à 1 mm est dilué avec du PBS prérefroidi, c'est - à - dire du PBS contenant 1 mm PMSF prérefroidi dans un bain de glace. Une solution aqueuse de PMSF doit être fraîchement formulée et sa demi - vie en phase aqueuse est d'environ 30 minutes.

Ajoutez 5 - 10 ml de PBS pré - refroidi (avec 1 mm PMSF), lavez les cellules, aspirez le liquide et essayez de ne pas laisser de liquide résiduel.

Ajouter 5 - 10 ml de PBS pré - refroidi (avec 1 mm PMSF), laver davantage les cellules, aspirer le liquide et essayer de garder aucun résidu de liquide.

8. Ajouter 1 ml de PBS prérefroidi (contenant 1 mm de PMSF), gratter les cellules avec un racleur cellulaire et les recueillir dans un tube de centrifugation. Comme les cellules peuvent être soufflées avec un pistolet, elles peuvent également être soufflées avec un pistolet. Les cellules sont comptées et divisées en environ un million de cellules par tube.

9. 4ºc, 800 - 1000g centrifuger pendant 1 - 2 minutes, bien précipiter les cellules. Si la précipitation s'avère insuffisante, le temps de centrifugation peut être prolongé de manière appropriée. Aspirez bien pour minimiser les résidus de liquide.

10.formulez une quantité appropriée de lysis buffer SDS contenant 1 mm de PMSF. Le précipité de 1 million de cellules de l'étape précédente a été remis en suspension avec 0,2 ml de SDS lysis buffer contenant 1 mm de PMSF.

11. Incuber sur un bain de glace pendant 10 minutes pour lyser adéquatement les cellules.

Sonication pour couper l'ADN génomique de sorte que la plupart de l'ADN est cassé à une taille de 200 - 1000 pb, mieux si la plupart des fragments peuvent être contrôlés à 400 - 800 pb. Faites attention à maintenir l'échantillon dans un bain de glace pour maintenir une température plus basse pendant l'échographie. L'effet du cisaillement par ultrasons peut être détecté par électrophorèse classique sur gel d'ADN - Agarose après une réticulation ultérieure. Les conditions de Sonication peuvent généralement être réglées à 10 secondes à chaque fois, 3 - 4 fois au total, à 30% de la puissance maximale à une puissance de 50 W, avec une tête à ultrasons de 2 mm.

Les paramètres des différents instruments de traitement par ultrasons ne sont pas tout à fait les mêmes, lors du tâtonnement des conditions d'ultrasons, vous pouvez d'abord fixer d'autres conditions, d'abord déterminer combien de temps chaque ultrason ne causera pas de chaleur évidente, puis tâtonner un nombre différent d'ultrasons. Jusqu'à ce qu'un nombre d'ultrasons plus approprié soit trouvé pour permettre à la plupart des génomesL'ADN est cassé à une taille de 200 - 1000 pb. Il convient de noter que le volume d'ultrasons et la quantité de cellules à chaque fois doivent être fixés, sinon vous ne pouvez pas utiliser une condition d'ultrasons relativement fixe pour des expériences ultérieures.

Note: dans le génome après échographieLors de la détection de la taille de l'ADN, si l'on utilise la méthode de coloration au gel d'agarose (c'est - à - dire la façon dont les colorants nucléiques sont ajoutés au tampon de chargement) ou la méthode de coloration par gélification, le SDS se combine avec ces colorants lors de l'électrophorèse pour former Des bandes anormales, généralement autour de 500 - 1000 pb, ce qui peut avoir un certain impact sur le jugement de la taille de l'ADN génomique après échographie. La détection de la taille des bandes est recommandée par la méthode de post - coloration, qui ne présente pas de bandes anormales, n'affecte pas le jugement de la taille de l'ADN génomique après échographie, et la taille des bandes est plus précise.

13. Ajouter 8 µl de NaCl 5m dans 0,2 ml d'échantillon soniqué et mélanger. Chauffer à 65ºc pendant 4 heures pour éliminer la réticulation entre la protéine et l'ADN génomique.

14. Ajouter un volume égal de tris balanceLe benzènefén，Le vortex est mélangé vigoureusement, puis centrifugé à 4ºc pendant environ 5 minutes à 12000g. Aspirer dans un autre tube de centrifugation.

15. Ajouter un volume égal de chloroforme, vortex mélanger vigoureusement, puis 4ºc, environ 12000g centrifuger pendant 5min. Aspirer dans un autre tube de centrifugation.

NotePour:Le retrait du phénol chloroforme des étapes 14 et 15 ci - dessus peut être opéré à l'aide d'un kit de purification d'ADN.

16. Prenez une petite quantité du liquide obtenu par l'extraction du phénol chloroforme ou du kit de purification de l'ADN, pour le produit d'extraction du phénol chloroforme peut prendre 5 - 10 µl, pour le produit de purification du kit de purification de l'ADN peut prendre 2 - 5 µl, effectuez l'électrophorèse sur gel d'Agarose, observez l'effet de cisaillement du traitement par ultrasons sur l'ADN génomique.

II. Immunoprécipitation de la chromatine:

1. Après l'optimisation des conditions de Sonication de l'échantillon, pour l'échantillon à détecterOptimisation des conditions de Sonication des échantillonscentre1 à 11Les étapes pour opérer et se référer aux étapes12 traitement par ultrasons.

2. Pour les échantillons soniqués à 4ºc, 12 000 - 14 000 g centrifugés pendant 5 min. Prélever le blanc (environ 0,2 ML) dans un tube à centrifuger de 2 ml et placer dans un bain de glace.

3.formulez la bonne quantité de Chip Solution Buffer contenant 1mm PMSF. On ajoute 1,8 ml de Chip Solution Buffer contenant 1 mm de PMSF pour diluer l'échantillon soniqué de manière à obtenir un volume final de 2 ml.

4. Retirez l'échantillon 20µl comme input pour la détection ultérieure. Prenez20 ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-perles magnétiquesajouterPBS ou tbst solution à 500 µl pour le nettoyage par soufflage, placé sur un rack magnétique avec une pipette pour laver soigneusement le surnageant, répéter le nettoyage 2 - 3 fois (pour une meilleure réduction de la non - spécificité 1 peut également être pré - Traité Beads avec 1 - 5% BSA ou lait écrémé pendant 1 heure).

5. Sera nettoyé ou fermé20 ul HA/DYKDDDDK/Myc/GFP-Nanoab-perles magnétiquesRejoindre les étapes3 dans les échantillons restants, des solutions d'échantillons acellulaires sont simultanément disponibles en tant que contrôles à blanc, ainsi que des échantillons sans Beads en tant que contrôles négatifs ou avec des anticorps indépendants en tant que contrôles négatifs. Mélanger en tournant lentement ou en agitant à 4 ° C pendant 30 - 60 min pour précipiter la protéine d'intérêt ou le complexe correspondant.

6. Placez le tube de centrifugation ci - dessus contenant l'échantillon sur le plateau magnétique pendant 10 S. retirez le surnageant très soigneusement et ne touchez jamais le précipité. Le précipité est ensuite lavé successivement avec la solution suivante, à raison de 1 mL par lavage, chaque fois en tournant lentement ou en agitant à 4 °C pendant 3 à 5 min, puis placé sur un plateau magnétique pendant 10 S. le liquide surnageant est soigneusement éliminé sans toucher au précipité.

A) le buffer WASH du complexe Low Salt Immune est lavé une fois.

B) Le High Salt Immune Complex WASH buffer est lavé une fois.

C) un lavage du tampon de lavage LiCl Immune Complex.

D) te buffer lavé deux fois.

NotePour:Le précipité obtenu à l'issue de toutes les étapes de lavage décrites ci - dessus peut être utilisé soit pour l'amplification par PCR de la séquence du gène d'intérêt, soit pour la détection de la séquence du gène d'intérêt avec Southern, soit pour la détection Western, etc.

Trois,Amplification par PCR de la séquence du gène d'intérêt (p. ex., les produits Chip sont utilisés pour détecter la séquence du gène d'intérêt):

1. Fraîchement formulé avec la bonne quantité de buffer elution (1% SDS, 0,1 m NaHCO3).

2. Terminer les étapesÉtapes d'immunoprécipitation第7Après l'étape, c'est - à - dire après avoir terminé toutes les étapes de lavage, ajouter250ul Elution buffer。 Le vortex est mélangé et l'élution est poursuivie par rotation ou Oscillation à température ambiante pendant 3 - 5 min.

3. Placez sur le plateau magnétique pour séparer pendant 10 secondes, transférer le dégagement supérieur dans un nouveau tube de centrifugation. 250 µl supplémentaires de buffer elution sont ajoutés au précipité. Le vortex est mélangé et l'élution est poursuivie par rotation ou Oscillation à température ambiante pendant 3 - 5 min.

4. Placez sur le support magnétique pour séparer pendant 10 secondes, retirez le dégagement supérieur. Et l'étape précédente est la fusion supérieure obtenue à l'étape 3. Au total, environ 500 µl sont purgés.

5. Ajouter 20 µl de NaCl 5m dans 500 µl de surnageant et mélanger. Chauffer à 65ºc pendant 4 heures pour éliminer la réticulation entre la protéine et l'ADN génomique. Pour 20 µl d'échantillon obtenu à l'étape 2D sous forme d'input, on ajoute 1 µl de NaCl 5m, malaxe et chauffe à 65°c pendant 4 heures, de même pour éliminer la réticulation entre la protéine et l'ADN génomique. Une fois cette étape terminée, vous pouvez procéder aux étapes suivantes ou vous pouvez d'abord geler à - 20ºc et continuer les étapes suivantes le lendemain.

Note1: l'échantillon à ce stade est déjà disponible pourPCR， On peut essayer d'utiliser un échantillon de 1, 2, 5 ou 10 µl comme modèle pour détecter le gène d'intérêt par PCR. À ce stade, l'effet de la PCR et la quantité d'ADN qui peut être précipité, et si l'ensemble du système d'amplification par PCR est susceptible d'amplifier le gène d'intérêt, sont liés. Si l'efficacité de la PCR est jugée insuffisante, vous pouvez envisager de purifier et de concentrer l'échantillon pour le test PCR par une étape de purification ultérieure.

Note2: en général, il est recommandé de procéder à une purification ultérieure suivieDétection par PCR, input n'a généralement pas besoin de procéder à des étapes de purification ultérieures.

6. Ajouter 10 µl d'EDTA 0,5 m, 20 µl de tris 1 m pH 6,5 et 1 µl de protéase K 20 mg / ML à environ 520 µl d'échantillon. Incuber à 45 °C pendant 60 minutes après malaxage.

7. Ajouter l'équilibre tris isovolumiqueLe benzènefén，Le vortex est mélangé vigoureusement, puis centrifugé à 4ºc pendant environ 5 minutes à 12000g. Aspirer dans un autre tube de centrifugation.

8. Ajouter un volume égal de chloroforme, vortex mélanger vigoureusement, puis 4ºc, environ 12000g centrifuger pendant 5 minutes. Aspirer dans un autre tube de centrifugation.

Ajouter 20 µg de Glycogen ou d'ARNt de l'année, ajouter 1 / 10 de volume de NAAC 3M, pH 5,2, ajouter 2,5 fois le volume d'éthanol absolu. Après malaxage - 70 ºC pendant au moins 1 heure ou - 20 ºC pendant plus de 8 heures.

10. 4ºc, 12 000 - 14 000 g centrifuger pendant 10 minutes, aspirer soigneusement la plupart du surnageant, ne jamais toucher le précipité.

11. On ajoute environ 1 mL d'éthanol à 70% pour laver le précipité. 4ºc, 12 000 - 14 000 g centrifuger pendant 10 min, aspirer soigneusement la plupart du surnageant, ne jamais toucher le précipité.

12. 4ºc, 12000 - 14000g centrifuger 1min, soigneusement aspirer le liquide résiduel.

13. Resuspendre le précipité d'ADN avec une petite quantité de te ou d'eau pour la détection PCR du gène d'intérêt. Les amorces pour la PCR sont mieux conçues pour 2 groupes, vous pouvez utiliser input comme modèle pour explorer les conditions PCR correspondantes à l'avance et sélectionner un ensemble d'amorces plus efficaces pour la détection PCR finale. Dans quelques cas, lorsque la bande de PCR est trop faible, la technique de PCR Nested peut être utilisée, avec deux tours d'amplification.

Note: Étapes7 à l'étape 13 l'ADN peut également être purifié à l'aide d'un kit de purification d'ADN approprié.

Quatre,Western teste les produits Chip (si les produits Chip sont utilisés pour Western teste):

1. Suivez les étapesImmunoprécipitation de la chromatine第8 étapes, après avoir terminé toutes les étapes de lavage, 25 µl de tampon SDS - page Upper - protein - like (1X) sont ajoutés. Le tampon sur protéine SDS - Page (1X) peut être formulé par dilution à l'eau du tampon sur protéine SDS - Page (5X). Le bain d'eau bouillante porte à ébullition pendant 10 minutes.

2. Prenez 10 - 20ul pour la détection occidentale.

Précautions:

1, besoin d'auto - approvisionnement pour chip, 37% de formaldéhyde, PBS，PMSF，Elutioin (1% SDS, 0.1M NaHCO3)， Protéase K, GLYCOGEN ou tRNA, équilibre TrisLe benzènefén, le chloroforme,éthanol à 95%, éthanol à 70%, NAAC 3M (pH 5,2) et racks magnétiques, racleurs cellulaires ou pelles cellulaires.

2, besoin de son propre appareil de traitement d'échantillons à ultrasons (sonicator), également connu sous le nom de Broyeur à ultrasons ou de Broyeur de cellules à ultrasons.

3, s'il vous plaît faire l'opération dans le placard de ventilation lors de l'utilisation de formaldéhyde.

4, ce produit est limité à l'usage de la recherche scientifique des professionnels, ne doit pas être utilisé pour le diagnostic clinique ou le traitement, ne doit pas être utilisé dans les aliments ou les médicaments, ne doit pas être stocké dans une résidence normale.

6, pour votre sécurité et votre santé, Veuillez porter des vêtements expérimentaux et utiliser des gants jetables.