Cell Free protein expression Kit - disulfure Link Enhanced Edition - poudre lyophilisée

Référence：P0243L

Conditions de stockagePour:-80℃，1anEfficace

Transport de glace sèche. Après ouverture, les composants réactionnels d'expression des protéines acellulaires sont conservés à - 80°c. Pour éviter le gel et la dégel répétés, les liquides a et B peuvent être stockés à - 80 ° c Après avoir été rapidement congelés avec de l'azote liquide après avoir été fractionnés séparément, en fonction de la quantité de réaction utilisée.

Composants du produit

Description du produit

Le kit de synthèse de protéines sans cellules (cell Free Protein Synthesis Kit) est unUn produit basé sur le lysat cellulaire d'e. Coli pour la synthèse de protéines in vitro. Ce produit utiliseRibosomes, facteurs de traduction, enzymes et autres substances actives dans le lysat cellulaire, tout en ajoutant de l'énergie,Nucléotides, acides aminés, sels inorganiques, etc., reconstitution de la transcription in vitro- système de traduction. Par ADN ouL'ARN est le modèle et exprime la protéine. L'expression de la protéine acellulaire est une espèce qui ne dépend pas des bactéries vivantes,Capacité d'exprimer des protéines rapidement et de manière flexible en grande quantité par rapport aux systèmes d'expression Recombinants traditionnelsAvantages multiples:

1. L'expression rapide de protéine, 1 ~ 2 h peut exprimer la protéine d'objectif, 8 ~ 24 h peut atteindre le maximumEn grande quantité.

2. L'expression de protéine est élevée, le Gao maximum peut atteindre plus de 3 mg / ml de protéine.

3. La réaction est simple et flexible, il suffit d'ajouter un modèle d'ADN ou d'ARN au système de réaction, peututiliserUne plaque 96 puits ou un tube de centrifugation effectue la réaction.

Note: ce produit peut exprimer des protéines conventionnelles et est plus approprié pour exprimer des protéines contenant des liaisons disulfures.

Champ d'application

Le produit Jin est limité à la recherche scientifique par des professionnels et ne doit pas être utilisé pour le diagnostic ou le traitement clinique, ni dans les aliments ou les médicaments.

Instructions d'utilisation

1. Construction génétique

La construction du gène d'intérêt est essentielle à l'expression de la protéine et la façon dont elle est construite est recommandée en utilisant le schéma ci - dessous. Le gène d'intérêt peut être construit sur le plasmide positif fourni avec ce kit (la carte des plasmides est détaillée dans le fichier QR - Code scan de l'étiquette de suremballage), c'est - à - dire de la manière suivante; Également compatible avec les plasmides de la famille PET contenant le promoteur T7, mais sans l'Opéron lactose (LAC) pet9a, PET - 23A, etc.

Remarque: les plasmides contenant l'Opéron lactose lac (p. ex., pet28a, etc.) peuvent avoir un impact important sur le rendement et ne sont pas recommandés pour une utilisation directe.

La séquence d'ADN du plasmide positif est schématisée ci - dessousPour:

2. Préparation du modèle

Les kits de synthèse de protéines acellulaires peuvent exprimer des protéines recombinantes en utilisant l'ADN ou l'ARNm comme matrice. Le gabarit d'ADN utilisé peut être un plasmide, un produit de PCR ou un produit d'amplification par boucle roulée RCA utilisant phi29.

2.1 plasmides: synthèse par société de gènes, ou sous - clonage pour obtenir un plasmide adapté à une réaction acellulaire et extraction du plasmide par purification sur colonne;

2.2 Produits de PCR: une amorce de conception, l'amorce avant étant d'environ 200 pb en amont du promoteur T7 et l'amorce inverse étant d'environ 200 pb en aval du codon de terminaison (contenant le Terminateur T7), la matrice est amplifiée et le fragment linéaire d'ADN obtenu peut être directement introduit sans purification dans un système réactif acellulaire. Le rôle des bases de 200 pb en amont et en aval est de protéger les fragments linéaires d'ADN contre la dégradation par les exonucléases endogènes.

2.3 Produits RCA: amplification en boucle roulée RCA à l'aide de la polymérase phi29, six amorces aléatoires, les produits d'ADN obtenus peuvent être utilisés directement dans des systèmes réactifs acellulaires.

2.4 La PCR et la RCA peuvent être associées à Golden Gate et Gibson Assembly, ce qui augmentera considérablement la vitesse et le flux de préparation des modèles d'ADN.

2.5La quantification précise est requise avant l'utilisation du modèle d'ADN; Il est recommandé d'utiliser un kit d'extraction plasmidique de haute qualité pour l'extraction plasmidique, en évitant l'introduction de RNase A; Les plasmides retournés par Gene Synthesis doivent être accentués en utilisant la méthode de purification de colonne, sinon ils ne peuvent pas être utilisés directement pour des réactions acellulaires.

3. Expression de protéines sans cellules

3.1Les liquides a et b nécessaires (rapport volumique 1: 2) sont calculés à partir de la quantité totale du système réactionnel, les réactifs utilisés sont ajoutés à la glace dans un récipient réactionnel (par exemple un tube à centrifuger à fond rond de 2 ml) et mélangés. Le processus d'opération nécessite le port complet de gants, de masques et l'utilisation d'une tête d'aspiration de pipette et d'un récipient de réaction sans source d'enzyme pour éviter l'introduction d'enzymes nucléiques.

Le système de réaction acellulaire peut être formulé en mélange en se référant au tableau suivant:

3.2Ajouter l'ADN modèle dans le système réactionnel, la concentration finale d'ajout de modèle d'ADN recommandé est de 5 ~ 10 μg / ML, peut être optimisé pour la quantité d'ajout de modèle d'ADN.

3.3Placez le récipient de réaction dans un shaker ordinaire ou un mélangeur thermostatique pour l'expression de protéines acellulaires, la température de réaction recommandée est de 25 ~ 30 ℃. Abaisser la température réduit le taux de synthèse des protéines, mais augmente leur solubilité. La production de protéine maximale peut être atteinte avec une réaction générale d'environ 8 h, ou avec une réaction d'une nuit de 16 h. lorsque la température de réaction diminue, le temps de réaction doit être augmenté de manière appropriée.

3.4L'expression acellulaire des protéines nécessite une quantité suffisante d'oxygène et, lorsqu'un tube de centrifugation à fond rond de 2 ml est utilisé comme récipient de réaction, le système réactionnel ne dépasse pas 100 µl. Les réactions acellulaires de protéine peuvent être amplifiées dans des proportions égales et le système réactionnel amplifié nécessite l'utilisation d'un récipient réactionnel plus grand, par example un shaker, etc., tout en garantissant la vitesse de rotation du Shaker (200 tr / min).

4. Détection

En fin de réaction, environ 1 µl du liquide réactionnel (détection de la totalité de la protéine) ou du surnageant réactionnel (détection de la protéine soluble) sont prélevés et l'expression de la protéine d'intérêt est détectée par électrophorèse sur gel de protéine SDS - page.

5. Contrôle positif

Le plasmide SF - GFP de la Protéine fluorescente verte est présent dans ce kit en tant que témoin positif et les résultats de la réaction peuvent être observés directement à l'œil nu. Après l'expression réussie de SF - GFP, le système de réponse acellulaire prendra une couleur verte prononcée.

Pour une quantification précise de la SF - GFP, la détection peut être effectuée à l'aide d'un étalon enzymatique (EX / em = 485 / 528 nm).