Référence：B1013/4/5/6

Conditions de stockage: - 20 ℃ stockage, le composant a doit être protégé de la lumière et éviter la congélation et la dégel répétées.

Composants du produitPour:

Présentation du produit

Une caractéristique remarquable de l'apoptose est la dégradation de l'ADN des Chromosomes cellulaires, qui est très spécifique et régulière, les fragments d'ADN produits de différentes longueurs étant des multiples entiers de 180 Pb - 200 pb, qui se manifestent par la présentation de profils ladder spécifiques en échelle en électrophorèse sur gel d'agarose. Ce kit utilise la méthode tunel pour l'incorporation catalytique de YF à l'extrémité 3´ - Oh - terminale de l'ADN fracturé dans des cellules apoptotiques en appliquant la terminal deoxynucleotidyl transferase (TDT). ®/ Cy-dUTP，YF ®/ L'ADN marqué CY - dUTP peut être observé directement par microscopie à fluorescence ou quantifié par cytométrie de flux. La méthode tunel permet de détecter sélectivement les cellules apoptotiques autres que les cellules nécrotiques ou les cellules dont les brins d'ADN se cassent en raison de l'irradiation et de la pharmacothérapie. Les dUTP étiquetés (tels que digaoxin - dUTP, wuxin - dUTP brut), qui peuvent être détectés directement in situ, sont un moyen de détection plus rapide et plus direct.

Ce kit a une large gamme d'applications et peut être utilisé pour détecter des cas d'apoptose dans des coupes congelées ou paraffiniques, mais aussi des cas d'apoptose de cellules plaquées en culture ou de cellules en suspension. Détection sélective des cellules apoptotiques autres que les cellules nécrotiques ou les cellules dont les brins d'ADN sont cassés par irradiation et traitement médicamenteux. Ce kit détecte l'apoptose, prend peu de temps, ne nécessite qu'une seule étape de réaction de coloration et peut être détecté après lavage.

mode d'emploi

Matériel expérimental (Self - contained)

Tampon PBS (pH ~ 7,4)

0,4% Triton X - 100 (formule PBS)

0,1% Triton X - 100 (formule PBS contenant 5 mg / mlbsa)

Paraformaldéhyde 4% (formule PBS)

Stylo immunohistochimique

Solvant de déparaffinage (échantillon de coupe de paraffine)

Réactifs associés au traitement des tranches de paraffine

Agent de scellement anti - fluorescent

ddH2O

Conception expérimentale

A. contrôles positifs

Le traitement dnasei prépare une lame témoin positive. DNase I peut digérer l'ADN simple ou double brin exposant l'extrémité 3 '- Oh, provoquant artificiellement l'apoptose. Faites - le une fois par expérience. (pour vérifier si cette opération expérimentale et le kit sont problématiques)

B. contrôles négatifs

Utilisation sans TDT Tunel par enzyme Réaction Buffer， Remplacer TDT par ddh2o Enzyme。 (principalement l'exclusion de la coloration non spécifique due à l'autoapoptose cellulaire, au processus de manipulation, etc.; et l'ajustement de l'intensité de l'exposition à la photographie.)

C. Groupe de traitement expérimental

Le Groupe expérimental fonctionne normalement selon les instructions.

D. groupe témoin expérimental

Le Groupe expérimental fonctionne normalement selon les instructions.

Étapes expérimentales

1, préparation de l'échantillon:

(1) pour cellules plaquées ou frottis cellulaires

A. PBS nettoyé 1 fois.

Remarque: Si vous craignez que les cellules du frottis cellulaire ne soient pas collées, vous pouvez sécher l'échantillon pour que les cellules soient collées plus fermement.

B. Fixation: ajouter la bonne quantité de paraformaldéhyde à 4% (formule PBS), fixer à 4 ℃ pendant 30 min. PBS nettoyé 2 fois.

C. perméable: ajouter la bonne quantité de 0,4% tritonx - 100 (formule PBS) et laisser passer à température ambiante pendant 20 minutes. PBS nettoyé 2 fois.

D. passez à l'étape 2. Réaction Tunel.

(2) pour les cellules en suspension ou les suspensions cellulaires

A. collecte des cellules (3 - 5 × 10⁶1 cellule), centrifuger à 1000 tr / min pendant 5 min et laver 2 fois au PBS.

B. Fixation: ajouter la bonne quantité de paraformaldéhyde à 4% (formule PBS) pour remettre les cellules en suspension suffisamment, fixer à 4 ° C pendant 30 min. Centrifuger 5 min à 2000 tr / min et laver 2 fois au PBS.

C. perméable: ajouter la bonne quantité de 0,4% tritonx - 100 (formule PBS) et laisser passer à température ambiante pendant 20 minutes. Centrifuger 5 min à 2000 tr / min et laver 2 fois au PBS.

D. passez à l'étape 2. Réaction Tunel.

(3) coupe de tissu paraffinique

A. Placez les tranches de paraffine sur un rack à tranches et faites cuire les tranches au four à 60 ° C pendant 60 min.

B. déparaffinage et hydratation: placer les échantillons tranchés successivement dans xylène I (10 min) xylène II (10 min) 100% éthanol I (5 min) 100% éthanol II (5 min) 95% éthanol (5 min) 90% éthanol (5 min) 80% éthanol (5 min) 70% éthanol (5 min) ddh2o rincer 5 min et rincer 2 fois.

Remarque: les xylènes sont toxiques et volatils, veuillez le faire dans un placard ventilé.

C. aspirer le liquide autour de l'échantillon tranché avec du papier filtre et utiliser un stylo immunohistochimique pour bien profiler l'échantillon afin qu'il soit perméable et marqué en aval.

Remarque: si le cercle de contour du dessin immunohistochimique est détruit lors d'une expérience ultérieure, le dessin doit être corrigé à temps.

D. perméable: diluer la solution de Proteinase K à 2 mg / ML avec du PBS à une concentration finale de 40 µg / ML dans un rapport de 1: 50, ajouter 100 µl goutte à goutte sur chaque échantillon de sorte que la solution couvre toute la zone de l'échantillon et incuber à 37 ° C pendant 30 min.

Remarque: Proteinase K perméabilise les membranes cellulaires et nucléaires, permettant ainsi aux réactifs de coloration des étapes suivantes d'entrer suffisamment dans le noyau pour réagir, améliorant ainsi l'efficacité du marquage. Une incubation trop longue augmente le risque de décollement de la tranche de tissu de la feuille porteuse lors des étapes de lavage ultérieures, et une durée trop courte peut entraîner un traitement de perméabilité inadéquat, affectant l'efficacité du marquage. Pour obtenir de meilleurs résultats, la concentration, le temps d'incubation et la température de Proteinase K doivent être optimisés en fonction des différents types d'échantillons de tissus.

E. immerger les échantillons tranchés dans 1 × PBS rincer trois fois pendant 5 minutes, aspirer l'excès de liquide avec du papier filtre et placer les échantillons traités dans une boîte humide pour les garder humides.

Remarque: Cette étape doit être nettoyée avec Proteinase K, sinon elle interférera sérieusement avec les réactions de marquage ultérieures.

F. tournez l'étape 2. La réaction de Tunel.

(4) coupe de tissu gelé

A. Fixation: retirer les tranches congelées et les remettre à température ambiante. Les échantillons tranchés sont immergés dans du paraformaldéhyde à 4% (formule PBS) et fixés à température ambiante pendant 30 min. Les échantillons tranchés sont immergés dans du PBS 1x rincé trois fois pendant 10 min chacun.

Remarque: Si vous craignez que le nettoyage au formaldéhyde ne soit pas propre, cela affecte l'effet final de la teinture. Une fois la fixation du formaldéhyde terminée, une quantité appropriée de 2 mg / ml d'acide glycanique peut être ajoutée pour le nettoyage pendant 10 min, neutralisant le liquide de fixation résiduel, puis effectuant un nettoyage au PBS.

B. utilisez du papier filtre pour aspirer le liquide autour de l'échantillon tranché et utilisez un stylo immunohistochimique pour bien profiler l'échantillon afin qu'il soit perméable et marqué en aval.

Remarque: si le cercle de contour du dessin immunohistochimique est détruit lors d'une expérience ultérieure, le dessin doit être corrigé à temps.

C. perméable: diluer la solution de Proteinase K à 2 mg / ML avec du PBS à une concentration finale de 40 µg / ML dans un rapport de 1: 50, ajouter 100 µl goutte à goutte sur chaque échantillon de sorte que la solution couvre toute la zone de l'échantillon et incuber à 37 ° C pendant 20 min.

Remarque: Proteinase K perméabilise les membranes cellulaires et nucléaires, ce qui permet de colorer les réactifs pour les étapes suivantesEntrez suffisamment dans le noyau pour réagir et améliorer l'efficacité du marquage. Une incubation trop longue augmente le risque de décollement de la tranche de tissu de la feuille porteuse lors des étapes de lavage ultérieures, et une durée trop courte peut entraîner un traitement de perméabilité inadéquat, affectant l'efficacité du marquage. Pour obtenir de meilleurs résultats, la concentration, le temps d'incubation et la température de Proteinase K doivent être optimisés en fonction des différents types d'échantillons de tissus. Si l'optimisation de la concentration de Proteinase K avec le temps d'incubation ne permet toujours pas d'améliorer l'effet de la coloration, les échantillons peuvent être immergés dans du Triton X - 100 à 1% (formulation PBS) avec une osmose à température ambiante de 3 à 5 min; Les échantillons tranchés sont ensuite immergés dans du PBS 1x rincé trois fois pendant 5 min chacun.

D. immerger les échantillons tranchés dans 1 × PBS rincer trois fois pendant 5 minutes, aspirer l'excès de liquide avec du papier filtre et placer les échantillons traités dans une boîte humide pour les garder humides.

Remarque: Cette étape doit être nettoyée avec proteinasek, sinon elle interférera sérieusement avec les réactions de marquage ultérieures.

E. passez à l'étape 2. Réaction Tunel.

(5) Traitement positif (seul le contrôle positif effectue cette étape, les autres échantillons effectuent directement l'étape de réaction tunel)

A. diluer 10 x DNase I buffer dans 1 x DNase I buffer avec ddh2o dans un rapport de 1: 10.

B. ajouter goutte à goutte 100 µl de 1 × DNase I buffer sur l'échantillon traité, couvrir toute la zone de l'échantillon et équilibrer la température ambiante pendant 5 min.

C. diluer le liquide de travail de DNase I (2 U / μl) à une concentration finale de 20 U / ML au 1: 100 avec 1 x DNase I buffer.

D. jeter buffer et ajouter 100 µl de dnasei à une concentration de 20 U / ML et incuber à température ambiante pendant 15 min.

E. jeter le liquide de travail DNase I et nettoyer 2 fois avec du PBS.

F. tournez l'étape 2. La réaction de Tunel.

La réaction tunel

(1) Formulation du liquide réactionnel tunel (prêt à l'emploi et prêt à l'emploi)

(2) pour les cellules plaquées, les frottis cellulaires ou les coupes de tissus

A. ajouter 50 μl de liquide réactionnel tunel pour chaque échantillon afin que le liquide réactionnel couvre uniformément l'échantillon. 37 ℃ incuber à l'abri de la lumière pendant le temps approprié (15 - 30minh recommandé pour la coloration des cellules, 1h recommandé pour la coloration des tissus).

Note: 50 μl Tunel Reaction Fluid convient aux plaques de frottis, de tranches ou de 96 puits (d'autres plaques de puits différentes peuvent ajuster le volume de tunel Reaction Fluid de manière appropriée, il suffit de couvrir les cellules). Si l'échantillon à détecter est frotté, tranché ou dans une plaque de 24 puits, une plaque de 12 puits ou une plaque de 6 puits, vous pouvez utiliser un film anti - vaporisation ou essayer de le découper vous - même en une feuille de plastique circulaire légèrement plus petite que les trous à l'aide d'un sac auto - adhésif ou d'un autre matériau approprié, recouvrir l'échantillon après avoir ajouté goutte à goutte le réactif tunel, ce qui peut empêcher l'évaporation du réactif tunel et permettre au réactif tunel de couvrir uniformément l'échantillon.

B. jeter le liquide réactionnel tunel, après 2 nettoyages PBS, puis 0,1% Triton X-100 (formule PBS, qui contient 5 mg / mlbsa) laver 3 fois pendant 5 min, de sorte que les marqueurs libres qui n'ont pas réagi peuvent être nettoyés.

C. (facultatif) Ajouter une quantité appropriée de colorant dapi à une concentration de 5 μg / ML par échantillon, à l'abri de la lumière, à température ambianteIncubation5min。 Une fois la teinture terminée, jetez la teinture dapi et nettoyez le PBS 2 fois pendant 5 minutes chacune.

D. (facultatif) tranches: 20 μl d'agent de scellement anti - Fluorescent par échantillon, goutte à goutte (antifluorescent)Le scellant de trempe peut ne pas convenir à certains colorants, pré - expérimental Test Match est recommandé avant l'expérienceSexe), couvrir la lame, tapoter doucement la lame avec l'extrémité émoussée de la pince à épiler, enlever les bulles d'air pour faire le joint WanTout- Oui.

E. aspirer l'excès de liquide avec du papier filtre et ajouter 100 μl à la zone d'échantillon Le PBS maintient l'échantillon humide,Observez immédiatement sous un microscope à fluorescence.

(3) pour les cellules en suspension ou les suspensions cellulaires

A. chaque tube d'échantillon ajoute 50 μltunel réactif doucement les cellules en suspension, 37 ℃ incuber à l'abri de la lumière15-30min。 Suspendre doucement les cellules avec une micropipette toutes les 10 minutes.

B. centrifugation à 2000 RPM pendant 5 min, élimination du liquide réactionnel tunel avec 0,1% Triton X-100(formule de PBS contenant 5 mg / ml BSA) nettoyez 2 fois, 5 min à chaque fois, nagez ainsiLes marqueurs éloignés qui n'ont pas réagi peuvent être nettoyés.

C. ajouter 100 μl de colorant dapi à une concentration de 5 μg / ML dans chaque tube d'échantillonnage et incuber à l'abri de la lumière à température ambiante pendant 5 min.

D. ajouter 400 μl Cellules PBS resuspendues, immédiatement détectées par cytométrie en flux ou après frottisObservé au microscope à fluorescence.

Précautions

1. S'il vous plaît centrifuger le produit momentanément au fond du tube avant utilisation, puis effectuer une expérience de suivi.

2. Le temps de teinture peut être réduit de manière appropriée lorsque le fond de teinture est lourd ou que la coloration non spécifique est évidente.

3. Il est recommandé d'augmenter les contrôles négatifs et les contrôles positifs au moment de l'expérience.

4. S'il vous plaît porter un masque, des gants lors de l'utilisation du composant a, si contact avec la peau, s'il vous plaît rincer immédiatement avec beaucoup d'eau.

5. Les colorants fluorescents ont tous des problèmes de trempe, essayez d'éviter la lumière pour ralentir la trempe fluorescente.

6. Ce produit est limité à la recherche scientifique, ne doit pas être utilisé pour le diagnostic clinique ou le traitement, ne doit pas être utilisé dans les aliments ou les médicaments, ne doit pas être stocké dans une résidence normale.

7. Pour votre sécurité et votre santé, Veuillez porter des vêtements expérimentaux et utiliser des gants jetables.