Extracteur d'acides nucléiques

Trizol total RNA extraction réactif

Numéro d'expédition du produit:R1000

Conditions de stockage:Trizol total RNA extraction réactifIl se conserve à température ambiante pendant 12 mois.Nous recommandons de conserver dansDans un environnement de 2 ~ 8 ° c.

Conseils importants:

Ce produit contient du phénol, qui est toxique et corrosif. En cas d'inhalation dans le corps, de contact avec la peau, d'ingestion, etc., il peut causer des intoxications, des brûlures et d'autres blessures corporelles. Des articles de protection tels que des gants, des masques pour les yeux, des masques faciaux, etc. doivent être portés lors de l'utilisation de cet article. En cas de contact accidentel, il faut immédiatement rincer abondamment à l'eau et se rendre à l'hôpital pour y être soigné.

Introduction du produit:

Trizol total RNA extraction réactifEst un réactif d'extraction d'ARN total de type à large spectre. L'opération expérimentale est rapide et pratique, les couleurs sont vives et faciles à superposer. Ce réactif peut être utilisé dans un large éventail d'applications et peut extraire l'ARN total d'échantillons de tissus animaux, de matériel végétal, de divers micro - organismes et de cellules de culture. La méthode a eu un meilleur effet d'isolement sur de petites quantités de tissus (50 - 100 mg) et de cellules (5 × 106), ainsi que sur de grandes quantités de tissus (≥ 1 g) et de cellules (> 107). L'échantillon est suffisamment clivé dans le réactif d'extraction d'ARN total trizol tout en permettant de garantir au maximum l'intégrité de l'ARN. Après centrifugation par addition de chloroforme, la solution est divisée en trois couches: une phase aqueuse incolore supérieure, une couche intermédiaire et une phase organique rouge inférieure, l'ARN étant réparti dans la couche supérieure de clearing. Une fois la couche supérieure collectée, l'ARN total peut être récupéré par précipitation dans l'isopropanol. L'ARN total extrait est bien intact, exempt de protéines et de contamination de l'ADN et peut être utilisé dans diverses expériences de routine en biologie moléculaire, telles que RT-PCR、Real-time RT-PCR、Northern blot、Dot Blot、 Traduction in vitro, etc.

Les réactifs d'extraction d'ARN total trizol favorisent la libération de nombreux ARN de différentes tailles moléculaires de différents genres. Par exemple, l'électrophorèse d'un gel d'agarose d'ARN prélevé dans le foie de rat et coloré avec du bromure d'éthidine a révélé de nombreuses bandes discontinues de haut poids moléculaire (ARNm et composants d'arnh) entre 7 KB et 15 KB, deux Ribosomes dominants ~ 5 KB (28S) et ~ 2 KB (18s) et des ARN de bas poids moléculaire entre 0,1 et 0,3 KB (ARNt, 5S). Lorsque l'ARN extrait est dilué avec te, son rapport a260 / A280 est ≥ 1,8. Notez que s'il s'agit d'une électrophorèse sur gel d'agarose ordinaire, la position du 28S est d'environ 2 KB et celle du 18s d'environ 1 KB, avec une grande variation de la position du gel à différentes concentrations.

Précautions:

1.Pour échantillonsAprès l'extraction de l'homogénat de réactif d'ARN total trizol, si le chloroforme n'est pas immédiatement ajouté avant, il peut être placé à - 70 ° C pendant plus d'un mois. L'ARN conservé dans l'éthanol à 75% précipite et peut être conservé pendant une semaine à 2 - 8°c et pendant 1 an à - 20°C. La demi - vie de l'ARN est relativement courte et se dégrade facilement, et il est recommandé d'effectuer des expériences de suivi dès que possible après l'extraction, telles que la transcription inverse en adnc, Northern Blot, etc.

Si les expériences en aval sont très sensibles à l'ADN, il est recommandé de traiter l'ARN avec RNase Free DNase I.

3.Réactifs autonomes: chloroforme, alcool isopropylique (Nouvelle ouverture ou ExtractionSpécifique à l'ARN), de l'éthanol à 75% (formulé avec de l'eau traitée au DEPC), de l'eau libre RNase ou de l'eau traitée au DEPC.

4. Cette société produit le réactif d'extraction d'ARN total trizol Reagent avec une excellente qualité et peut remplacer trizol Reagent d'INVITROGEN. La qualité d'extraction est la même que pour les expériences en aval *.

Étapes de l'opération de retrait d'ARN: (veuillez lire les précautions avant l'expérience)

Indice :

UtiliserTrizol total RNA Extract Reagent portez des gants et un masque oculaire lorsque vous retirez l'ARN. Évitez tout contact avec la peau et les vêtements. Terminer l'opération dans le placard de ventilation chimique. Évitez l'inhalation respiratoire. Sans instructions spéciales, toutes les opérations doivent être à la température ambiante de 15 ~ 30 ° c.

1. Homogénat

A) tissus végétaux:

Prise de tissus végétaux frais après broyage adéquat dans l'azote liquide ou traitement de broyage des tissus végétaux directement dansTrizol total RNA extraction réactifBroyer rapidement à moyen, ajouter 1 ml de trizol total RNA extraction réactif pour 50 - 100 mg de tissu, mélanger. Remarque: le volume de l'échantillon ne doit généralement pas dépasser 10% du volume total du réactif d'extraction d'ARN trizol.

B) organisations animales:

Prendre frais ou- 70 ℃ lyophiliser les tissus animaux autant que possible, ajouter 1 ml de réactif d'extraction d'ARN total trizol par 30 - 100 mg de tissu, homogénateur pour le traitement de l'homogénat. Soit 1 ml du réactif total d'extraction d'ARN trizol est mélangé par addition après Trituration dans l'azote liquide. Remarque: le volume de l'échantillon ne doit généralement pas dépasser 10% du volume total du réactif d'extraction d'ARN trizol.

C. cellules en culture monocouche:

Essayez d'enlever le liquide de culture résiduel propre directement au diamètreDans une plaque de culture de 3,5 cm, on ajoute 1 ml du réactif d'extraction d'ARN total trizol pour couvrir et souffler à plusieurs reprises les cellules lysées. La quantité totale de réactif d'extraction d'ARN trizol nécessaire (plus 1 mL pour 10 cm 2) est déterminée en fonction de la surface de la plaque de culture plutôt que du nombre de cellules. Lorsque la quantité de réactif d'extraction d'ARN total de trizol est insuffisante, cela peut entraîner une contamination de l'ADN dans l'ARN extrait.

Attention:

Les cellules de culture collées ont tendance à ne pas * tomber du flacon (boîte de pétri), ce qui ne signifie pas que la lyse ne se produit pas *, à ce moment - là, la membrane cellulaire a effectivement * éclaté et tout a été libéré.RNA， Continuez à le faire.

D. suspension cellulaire:

Les cellules sont collectées par centrifugation. DansTrizol total RNA Extract Reagent les cellules lysées sont soufflées à plusieurs reprises avec une pipette. Tous les 5 ~ 10 ×10⁶Cellules animales, végétales ou de levures ou 1 mL pour 1 × 107 bactéries plusTrizol total RNA extraction réactifLe lavage des cellules doit être évité avant l'ajout du réactif d'extraction d'ARN total trizol, car cela augmente la probabilité de dégradation de l'ARNm. La rupture de certaines levures et bactéries peut nécessiter l'utilisation d'homogénateurs.

F. sang:

utiliserTrizol total RNA extraction réactifRéactif LS.

2.Placer l'échantillon d'homogénat à température ambiante après une forte commotion5 minutes pour dissocier les nucléosomes *.

3. Étapes facultatives:

DansForce centrifuge à 12000 RPM à 4°CCentrifuger pendant 10 minutes et retirer.

Si l'échantillon contient plus de protéines, de graisses, de Polysaccharides ou de muscles, les tubercules de plantes, etc. peuvent être éliminés par centrifugation. Le précipité après centrifugation contient des membranes extracellulaires, des polysaccharides et un poids moléculaire élevéDNA， Le surnageant contient de l'ARN. Lors du traitement d'un échantillon de tissu adipeux, la couche supérieure est une grande quantité d'huile qui doit être éliminée. Prenez l'homogénat clarifié pour l'étape suivante.

4.Chaque1 mlTrizol total RNA extraction réactifAjouter 0,2 ml de chloroforme. Fermer le couvercle du tube, secouer vigoureusement pendant 15 secondes et le laisser à température ambiante pendant 2 à 3 minutes.

5.DansCryocentrifugation à grande vitesse avec une force centrifuge de 12 000 tr / min à 4 ° C pendant 10 - 15 minutes. Après centrifugation, le mélange est divisé en trois couches: une couche inférieure de chloroforme organophénolique rouge, une couche intermédiaire et une couche supérieure d'échantillon d'eau incolore. L'ARN est présent dans la couche aqueuse sans exception. La capacité de la couche d'échantillon d'eau est d'environ 50 à 60% de la capacité totale du réactif d'extraction d'ARN trizol ajouté. (la couche organique et la couche intermédiaire sont des protéines et de l'ADN, si l'extraction est nécessaire, contactez - nous pour une méthode d'extraction).

6.Transférer la couche d'échantillon d'eau dans un tube de centrifugation propre et ajouter un volume égal d'alcool isopropylique. Placer à température ambiante après mélange inversé10 minutes.

Les précipités d'ARN ne sont généralement pas visibles avant la centrifugation, après quoi un précipité gélatineux se forme côté tube et au fond du tube.

7.à température ambiante ouCentrifuger à 4°C à 12 000 tr / min pendant 10 minutes et défricher.

8.AdhérerLe précipité est lavé à l'éthanol à 75%. Le précipité est lavé par 1 mL d'éthanol à 75% pour 1 ml de réactif d'extraction d'ARN total trizol.

9.à température ambiante ouCentrifuger à 4°C à 12000 RPM pendant 3 minutes, abandonner le surnageant en prenant soin de ne pas perdre le précipité d'ARN.

Remarque: la petite quantité restante de liquide peut être brièvement centrifugée, puis aspirée avec la tête du pistolet, en prenant soin de ne pas rejeter le précipité.

10.Placement à température ambiante2 - 3 minutes, laisser sécher. Ajouter 30 - 100 μl de RNase eau libre, dissoudre suffisamment l'ARN et l'ARN résultant est conservé à - 70 ° C, empêchant la dégradation.

Remarque: la petite quantité restante de liquide peut être brièvement centrifugée, puis aspirée avec la tête du pistolet, en prenant soin de ne pas rejeter le précipité.