Expériences d'interaction moléculaire: cut & amp; Tag targeted Cutting et étiquetage

I. Introduction technique

Cut & Tag est une technologie d'analyse épigénomique de haute sensibilité basée sur la coupure ciblée de la chromatine guidée par des anticorps et l'étiquetage, qui surmonte les goulots d'étranglement tels que la faible sensibilité, le bruit de fond élevé, la forte demande d'échantillons de Chip - seq traditionnel, peut analyser les caractéristiques de la chromatine telles que la modification des histones, la liaison des facteurs de transcription au niveau unicellulaire, devenant ainsi une nouvelle recherche en épigénétique.direction- Oui.

II. Principes techniques

Cut & Tag permet une analyse précise de la chromatine grâce à une réaction clé en quatre étapes:

1. Localisation ciblée des anticorps:Un anticorps spécifique (par exemple, l'anticorps h3k4me3) se lie à la région de la chromatine cible et le Protein A / G II est porteur du complexe tn5 transposase (contenant le coupleur de séquençage).

2. Découpe et étiquetage ciblés:Tn5 transposase sous la direction de l'anticorps, la chromatine cible est soumise à une coupure double brin de l'ADN avec ligature de liaison, gamme de coupure: environ 50 - 300 pb de chaque côté du site cible.

3. Libération de fragments d'ADN:La protéase K digère la réticulation de la chromatine, libérant des fragments d'ADN avec des joints.

Construction et séquençage de la bibliothèque:Amplification PCR du fragment cible, construction de la Bibliothèque de séquençage illumina, profondeur de séquençage: ~ 20 millions de lectures / Samples (50% de moins que Chip - SEQ).

Iii. Scénarios d'application

Cut & Tag révèle des différences épigénétiques dans différentes sous - populations du microenvironnement tumoral au niveau unicellulaire.

Par exemple:

Cancer du sein triple négatif: on a découvert, par cut & Tag unicellulaire, que des super - Enhancer régulés par foxa1, qui pilotent l'expression de gènes clés de l'EMT (transformation épithéliale - mésenchymateuse), tels que snai1, favorisent les métastases, sont activés spécifiquement dans les isoformes basales.

Leucémie myéloïde aiguë: le suivi d’échantillons de moelle osseuse de patients récidivants a permis d’identifier des changements dynamiques dans la modification de h3k4me1 dans les cellules souches CD34 +, qui prédisent la création d’une résistance à la chimiothérapie, offrant de nouvelles cibles pour les thérapies ciblées apparentes.

Reprogrammation apparente du développement embryonnaire: cut & Tag peut suivre le processus d'établissement dynamique de la modification des histones dans le développement embryonnaire précoce.

Embryons préimplantatoires de souris: on a constaté que h3k9me3 commençait à se déposer au stade 2 - cellule, marquant préférentiellement les régions rétrotransposons (comme Line - 1), une modification qui maintient la stabilité génomique en inhibant l'activité transposon.

Cellules souches embryonnaires humaines: cartographie dynamique de h3k27ac dans la différenciation neuronale, localisant les réseaux d'amplificateurs régulés par sox2 et oct4, révélant des nœuds clés de sortie de pluripotence.

Régulation fonctionnelle des cellules immunitaires: analyse des bases apparentes de la différenciation et de l'état fonctionnel des cellules T.

Déplétion des lymphocytes T: dans un modèle d'infection virale chronique, h3k27ac des lymphocytes T CD8 + déplétissants s'est avéré anormalement enrichi aux locus Pd - 1 et Tim - 3, et l'activité de ces amplificateurs est directement régulée par le facteur de transcription Tox.

Cellules T régulatrices (Treg): l'Association Atac - seq a révélé que foxp3 stabilise la fonction inhibitrice des cellules Treg en remodelant la modification h3k4me3, un processus qui repose sur l'inhibition synergique de h3k27me3 médiée par EZH2.

Iv. Avantages techniques

1. Sensibilité plus élevée (100 tests au niveau cellulaire): la transposase tn5 coupe et relie les joints de séquençage directement au site cible, évitant la perte aléatoire causée par la fragmentation de l'ADN (fragmentation ultrasonore) dans Chip - seq. Le rapport signal sur bruit de cut & Tag a été multiplié par 8 (S / n = 12: 1 vs 1,5: 1) et le nombre de pics de différence détectés a augmenté de 40% par rapport à Chip - seq.

Résolution monobasique et localisation précise: le complexe anticorps - tn5 ne coupe que l'ADN près du site de liaison (± 50 Pb), tandis que la fragmentation ultrasonique de Chip - seq produit des fragments aléatoires de 200 à 500 pb. Dans l'analyse du site de liaison p53, cut & Tag a détecté un seul pic étroit (largeur du pic ≈ 30 Pb), tandis que Chip - seq présentait un pic large (largeur du pic ≈ 200 Pb), le premier pouvant être localisé avec précision au Centre du motif ttgcct.

Compatibilité épiomique unicellulaire et spatiale: la construction de l'Atlas unicellulaire h3k27ac a été réalisée en combinant la plate - forme 10x Genomics pour envelopper des cellules individuelles avec un complexe anticorps - tn5 dans des gouttelettes d'huile par microfluidique (Nature Methods, 2022).

La nouvelle technologie cut & Tag spatiale permet de localiser la distribution sous - structurelle de h3k4me3 sur des coupes de tissus, par exemple pour visualiser les modifications liées à l'activité neuronale dans la région hippocampique dans des coupes de cerveau de souris.

V. types d'échantillons

Cellules fraîches (cellules collées / cellules en suspension), cellules lyophilisées, tissus lyophilisés.

Vi. Besoins en échantillons

Échantillons cellulaires: environ 100 000 (il peut s'agir d'un puits dans une plaque de 24 puits ou stockés dans un tube à centrifuger sous forme de cellules en suspension);

Tissu congelé: environ 10 - 20 mg.

Vii. Préparation et transport des échantillons

Échantillons de cellules vivantes: des échantillons frais peuvent être fournis à une distance plus proche, les échantillons de cellules fraîches cultivés à l'intérieur d'une boîte de conserve / tube de centrifugation sont expédiés par courrier normal (au plus tard le lendemain), livraison flash ou livraison en personne dans la ville; Distance plus longue, peut - 80 ℃ transport de glace sèche cellulaire stockée congelée;

Échantillon de tissu: - transport de glace sèche congelée à 80 ° c.

Viii. Réactifs à fournir

Anticorps de qualité Chip (vous pouvez également sélectionner des anticorps de qualité if lorsque vous n'en avez pas)

Ix. Cycle expérimental

1 - 2 semaines (ne contient pas de séquençage)

X. Autres

Détection ultérieure rrealtime PCR / séquençage