Expériences moléculaires interactions moléculaires: pull down pull down

I. Introduction technique

L'expérience pull downL'expérience pull - down est une technique de purification d'affinité in vitro.

II. Principes techniques

Fixer une protéine sur une certaine matrice (commeSéfarose), mais les protéines Ligands qui peuvent interagir avec cette protéine immobilisée sont adsorbées lorsque le prélèvement cellulaire traverse cette matrice, tandis que les « impuretés » qui ne sont pas adsorbées sortent avec l'éluant. Les protéines adsorbées peuvent être récupérées en modifiant l'éluant ou les conditions d'élution.

Iii. Scénarios d'application

Vérification des interactions protéiques connues: en effectuant une expérience pull - down avec une protéine d'appât connue et une protéine de proie susceptible d'interagir, si la présence de la protéine de proie est détectée, l'interaction entre les deux peut être vérifiée.

Criblage des interactions protéiques inconnues: la protéine appât est soumise à une expérience pull - down avec un lysat cellulaire ou un autre mélange de protéines, puis la protéine liée est identifiée, ce qui permet de cribler les protéines inconnues qui interagissent avec la protéine appât.

3. Étudier la composition du complexe protéique: l'isolement du complexe protéique par l'expérience pull - down, puis l'identification des protéines dans le complexe, peut déterminer les composants constitutifs du complexe protéique.

4. Étudier l'interaction protéine - acide nucléique: en utilisant la technologie pull - down d'ADN et pull - down d'ARN, l'interaction entre la protéine et l'ADN, l'ARN peut être étudiée, telle que la liaison du facteur de transcription au promoteur, la liaison de la protéine de liaison d'ARN à l'ARN, etc.

Iv. Avantages techniques

Il est possible de déterminer si une interaction directe peut se produire entre la protéine d'intérêt et la protéine de détection.

V. types d'échantillons

Cellules fraîches (cellules collées / cellules en suspension), cellules lyophilisées, tissus lyophilisés, échantillons de lysat.

Vi. Besoins en échantillons

Échantillons cellulaires: environ 5 × 10 ^ 6 (il peut s'agir de 2 boîtes de 6 cm ou stockées dans des tubes à centrifuger sous forme de cellules en suspension, ou de 2 flacons t25);

Lyophilisation des tissus: environ 40 mg;

Échantillon de lysat: la concentration en protéines n'est pas inférieure à 2 mg / mg et la quantité totale de protéines n'est pas inférieure à 3 mg.

Vii. Préparation et transport des échantillons

Échantillons de cellules vivantes: des échantillons frais peuvent être fournis à une distance plus proche, des échantillons de cellules fraîches peuvent être expédiés par courrier normal (au plus tard le lendemain) à l'intérieur d'une boîte de conserve / bouteille t25 / tube de centrifugation, livraison flash ou livraison en personne dans la Ville, expédition de glace sèche cellulaire congelée à - 80 ℃;

Échantillons de tissus et échantillons de lysat: - 80 ℃ transport de glace sèche congelée.

Viii. Réactifs à fournir

Si le test WB est effectué, les anticorps correspondants doivent être fournis.

Ix. Cycle expérimental

3 - 4 semaines (ne contient pas de spectrométrie de masse)

X. Autres

RNA-Pull-down、DNA-Pull-down、GST-Pull-down， Il est nécessaire d'informer le genre et la protéine cible, de tester ultérieurement le Western Blot / Protein mass spectrometry, et le coût de l'expression in vitro de la protéine de fusion doit être calculé sur la base d'une évaluation individuelle de la protéine cible spécifique.

Facteurs de transcription, certaines expériences peuvent également utiliser des protéines exprimées recombinantes.

Vi. Besoins en échantillons

Échantillons cellulaires: environ 1 × 10 ^ 7 (il peut s'agir d'une boîte de 10 cm ou stockée dans un tube à centrifuger sous forme de cellules en suspension, ou d'un flacon T75);

Tissu congelé: environ 400 mg;

Tissus végétaux: environ 2 G; nucléoprotéines, facteurs de transcription purifiés, protéines d'expression recombinantes, etc.: chaque Membrane fournit au moins 50 µl à une concentration d'au moins 0,5 mg / ML.

Vii. Préparation et transport des échantillons

Échantillons de cellules vivantes: les plus proches peuvent transporter des échantillons de cellules fraîches dans des boîtes de conserve / bouteilles T75 / tubes à centrifuger par courrier normal (au plus tard le lendemain), livraison flash ou livraison en personne dans la Ville, les plus éloignés peuvent transporter de la glace sèche cellulaire congelée à - 80 ℃;

Échantillons de tissus et autres échantillons liquides: - transport de glace sèche congelée à 80 ℃.

Viii. Réactifs à fournir

Les anticorps spécifiques de la protéine de liaison sont supérieurs à 50 µl à des concentrations supérieures à 0,5 mg / ML.

Ix. Cycle expérimental

2 - 3 semaines

X. Autres

Séquence de sonde, p. ex. séquence sans sonde, veuillez fournir des renseignements sur les protéines liant l'ADN ou de la littérature pertinente.