Expériences d'interaction moléculaire: RIP (RNA immunoprécipitation)

I. Introduction technique

La technique RIP (RNA immunoprecipitation, ARN immunoprecipitation) est une méthode expérimentale clé pour étudier l'interaction de l'ARN avec les protéines intracellulaires, capable de révéler les mécanismes fonctionnels de la protéine de liaison à l'ARN (RBP) dans la régulation post - transcriptionnelle.

II. Principes techniques

Rip utilise des anticorps dirigés contre la protéine cible pour précipiter le complexe ARN - protéine correspondant, purifié par isolement et validé par RT - PCR ou séquencé pour l'ARN lié au complexe, avec des résultats plus biologiquement convaincants.

Iii. Scénarios d'application

Mécanisme fondamental: analyse de la fonction des protéines liant l'ARN (par exemple, ago2, complexe polycomb) et des réseaux de régulation de l'ARN.

Recherche sur la maladie: comparer les différences d'interaction entre les protéines ARN et les maladies dans les échantillons normaux et trouver des biomarqueurs potentiels (par exemple, lncrna lié au cancer).

Développement de médicaments: Évaluer l'impact des médicaments sur l'interaction ARN - protéine et accélérer le dépistage des cibles.

Iv. Avantages techniques

1. Sensibilité élevée: faible interaction de l'ARN d'abondance faible avec la protéine peut être détectée.

2. Large gamme dynamique: de petites cellules (par exemple 5 × 10 ⁷) à des échantillons de tissus complexes sont applicables.

Utilisation Multi - groupes: combiner ARN - seq, Clip - seq ou Chip - seq pour construire des réseaux de régulation multidimensionnels.

V. types d'échantillons

Cellules fraîches (cellules collées / cellules en suspension), cellules lyophilisées, tissus lyophilisés, échantillons de cellules post - réticulées.

Vi. Besoins en échantillons

Échantillons cellulaires: environ 1 × 10 ^ 7 (il peut s'agir d'une boîte de 10 cm ou stockée dans un tube à centrifuger sous forme de cellules en suspension, ou d'un flacon T75);

Lyophilisation des tissus: environ 70 MG; Échantillons de cellules réticulées: les cellules ont été traitées par réticulation au formaldéhyde à 1%.

Vii. Préparation et transport des échantillons

Échantillons de cellules vivantes: les plus proches peuvent transporter des échantillons de cellules fraîches dans des boîtes de conserve / bouteilles T75 / tubes à centrifuger par courrier normal (au plus tard le lendemain), livraison flash ou livraison en personne dans la Ville, les plus éloignés peuvent transporter de la glace sèche cellulaire congelée à - 80 ℃;

Échantillons de tissus et échantillons cellulaires après réticulation: - 80 ℃ transport de glace sèche congelée.

Viii. Réactifs à fournir

Détection avec des anticorps de qualité chip.

Ix. Cycle expérimental

1 - 2 semaines (ne contient pas de séquençage)

X. Autres

Détection ultérieure lorsque vous sélectionnez RT PCR, vous devez fournir les sites de détection ultérieure.

Étapes spécifiques pour la réticulation des cellules par le formaldéhyde: ① ajouter du formaldéhyde à une concentration finale de 1% dans la boîte de cellules, incuber à 37 ° C pendant 10 minutes; ② les cellules sont lavées deux fois avec du dpbs glacé contenant [PMSF 1 mm, 1 µg / ml d'inhibitase et 1 µg / ml de pepstatine a]. ③ grattez les cellules dans 2 ml de dpbs glacé contenant l'inhibiteur de protéase et Transférez - les dans un tube à centrifuger où elles sont congelées et envoyées.