Expériences d'interaction moléculaire: co - précipitation immunologique de la chromatine Chip

I. Introduction technique

Chip (chromatine immuno - coprécipitation) est une technique clé pour étudier l'interaction des protéines avec l'ADN, largement utilisée dans les domaines de l'identification des sites de liaison des facteurs de transcription, de l'analyse des modifications épigénétiques, etc.

II. Principes techniques

En utilisant la liaison spécifique d'anticorps antigéniques, les fragments d'ADN liés à la protéine d'intérêt sont précipités, capables de refléter fidèlement les protéines régulatrices liées à la séquence d'ADN.

Iii. Scénarios d'application

1. Recherche sur la régulation transcriptionnelle: identification des facteurs de transcription (p. ex.P53, NF - κb) sites de liaison à l'ADN.

2. épigénétique: analyse des modifications histoniques (p. ex.H3k27me3) pour son rôle dans le gene silencing.

3. Mécanismes de la maladie: explorer les modèles de liaison génomique des protéines anormales telles que myc dans le cancer.

4. Peut être associé àDes techniques telles que QPCR, SEQ sont associées.

Iv. Avantages techniques

Le Chip capture la liaison dynamique des protéines à l'ADN à l'état réel à l'intérieur des cellules par réticulation au formaldéhyde, évitant les faux négatifs ou les faux positifs dans les expériences in vitro et est particulièrement adapté à l'étude des événements de liaison transitoires tels que les facteurs de transcription.EtLes anticorps spécifiques peuventEtUn fragment d'ADN enrichi avec précision lié à la protéine cible, associé à la QPCR ou au séquençage (chip - SEQ) pour une détection aussi faible que Kilo - cellulaire (par exemple, des kits d'optimisation) avec une sensibilité significativeEt sont largement applicables.

V. types d'échantillons

Cellules fraîches (cellules collées / cellules en suspension), cellules lyophilisées, tissus lyophilisés, échantillons de cellules post - réticulées.

Vi. Besoins en échantillons

Échantillons cellulaires: environ 1 × 10 ^ 7 (il peut s'agir d'une boîte de 10 cm ou stockée dans un tube à centrifuger sous forme de cellules en suspension, ou d'un flacon T75);

Lyophilisation des tissus: environ 70 MG;

Échantillons de cellules réticulées: les cellules sont traitées par réticulation au formaldéhyde à 1%.

Vii. Préparation et transport des échantillons

Échantillons de cellules vivantes: les plus proches peuvent transporter des échantillons de cellules fraîches dans des boîtes de conserve / bouteilles T75 / tubes à centrifuger par courrier normal (au plus tard le lendemain), livraison flash ou livraison en personne dans la Ville, les plus éloignés peuvent transporter de la glace sèche cellulaire congelée à - 80 ℃;

Échantillons de tissus et échantillons cellulaires après réticulation: - 80 ℃ transport de glace sèche congelée.

Viii. Réactifs à fournir

Détection avec des anticorps de qualité chip.

Ix. Cycle expérimental

1 - 2 semaines (ne contient pas de séquençage)

X. Autres

Détection ultérieure lorsque vous sélectionnez RT PCR, vous devez fournir les sites de détection ultérieure.

Étapes spécifiques pour la réticulation des cellules par le formaldéhyde: ① ajouter du formaldéhyde à une concentration finale de 1% dans la boîte de cellules, incuber à 37 ° C pendant 10 minutes; ② les cellules sont lavées deux fois avec du dpbs glacé contenant [PMSF 1 mm, 1 µg / ml d'inhibitase et 1 µg / ml de pepstatine a]. ③ grattez les cellules dans 2 ml de dpbs glacé contenant l'inhibiteur de protéase et Transférez - les dans un tube à centrifuger où elles sont congelées et envoyées.