Rnafixer liquide de stockage d'échantillons d'ARN sans azote liquide

Propriétés de la marchandise:

Conditions de conservation:

La température ambiante (18 - 25 ℃) conserve plus de 1 an, si l'utilisation trouve un précipité ou un dégagement, peut être 37 ℃ bain d'eau plusUtilisé après redissolution à chaud, il n'affecte pas la qualité du produit après redissolution.
Introduction du produit:
Rnafixer est un liquide liquide non toxique de préservation des tissus qui pénètre rapidement dans le cytoplasme des cellules tissulaires fraîchesIn situ stabilise et protège l'ARN dans la cellule à l'état non gelé. L'immersion dans la préservation rnafixer immédiatement après le retrait des flocons de tissu n'affecte pas la qualité et la quantité d'ARN extrait à l'avenir. Rnafixer élimine les échantillons d'ARN qui doivent être traités immédiatementOu l'inconfort de devoir conserver l'azote liquide. Après immersion dans rnafixer, l'ARN peut être intact dans les cellules des tissus fraisUn jour à 37 ℃, une semaine à 25 ℃, un mois à 4 ℃, et à long terme à - 20 ℃ ou - 80 ℃.
Les échantillons de virus à ARN (tels que le VHC et le VIH) peuvent être conservés à 37 ° C pendant un mois.Convient aux tissus animaux (cœur, foie, rein, muscle, testicules, cerveau, rate, etc.), aux cellules en culture, aux virus à ARN, aux fruitsMouches, bactéries, globules blancs, certains tissus végétaux, etc.
Caractéristiques du produit:
1. Facile à utiliser: organiser à la bonne taille, immergé dans rnafixer peut rendre son ARN non dégradé.
2. Pas besoin d'azote liquide: pour que la conservation de l'échantillon ne nécessite pas d'azote liquide, de glace sèche ou de réfrigérateur à - 80 ℃, en particulier pour les échantillons cliniques et de terrainAcquisition rapide et à grande échelle.
3. Facile à transporter: les échantillons traités peuvent être conservés pendant une semaine à 25 ℃, ce qui rend l'envoi et le transport des échantillons faciles et bon marché, avantageuxCoopération et échanges académiques.
4. Congélation et dégel multiples: les échantillons traités par rnafixer peuvent être congelés et dégelés à plusieurs reprises, entre lesquels divers traitements peuvent être effectués sur les échantillonsSans affecter la qualité de l'ARN finalement extrait.
Forte comparabilité: rnafixer peut réduire les erreurs dans le traitement des échantillons à grande échelle et augmenter la comparabilité entre les expériences, particulièrement utile pour l'analyse de profils d'expression génique à grande échelle.
Instructions d'utilisation:
Rnafixer est utilisé uniquement sur les tissus frais, la congélation des tissus est interdite avant immersion dans rnafixer. Il suffit de mettre rapidement le nouveauTissu frais en croissance, large, haut n'importe quel côté épaisseur < 0,5 cm tremper dans rnafixer est correct (tant qu'il y a un côté épaisLe degré ne dépasse pas 0,5 cm, rnafixer peut pénétrer rapidement, la taille des autres côtés n'a pas d'importance). Mettre le groupe fraisLe tissu est trempé dans 5 fois le volume de rnafixer et stocké à la température appropriée comme indiqué.
Le rnafixer de tissu animal ne détruit pas ou ne dissout pas la structure de tissu, ainsi l'immersion dans le rnafixer atteint la pénétrationLe tissu équilibré peut être retiré du rnafixer, puis coupé en morceaux plus petits et remis dans le rnafixerContinuez à l'utiliser la prochaine fois. Les petits organes tels que le foie de souris, les reins, la rate n'ont pas besoin d'être cisaillés et peuvent être stockés intacts dans rnafixer.
Quantité recommandée d'utilisation de rnastore pour différents échantillons de tissus:

2. Tissus végétaux beaucoup de tissus végétaux sont directement immergés dans rnafixer peut être, certaines plantes ont une barrière de pénétration naturelle comme la strateLa couche protectrice, qui doit d'abord détruire la stratosphère, facilite la pénétration de rnafixer.
3. Après les cellules de culture tissulaire soufflé vers le bas, les cellules sont recueillies par centrifugation, défrichées, lavées une fois avec le tampon PBS du bain de glaceEnlever le liquide de culture résiduel. Les cellules sont mises en suspension dans une petite quantité de tampon PBS. Ajouter cinq à dix fois le volume rnafixer, mélangerTous.
4. Leucocytes pour la préservation des leucocytes dans le sang total, les leucocytes doivent être isolés des globules rouges et du sérum et classés par groupeAprès traitement des cellules tissulaires, les globules blancs peuvent être conservés efficacement dans le rnafixer. Ne placez pas de sang total, de plasmaOu les ARN dans le sérum sont conservés dans rnafixer car ils sont trop riches en protéines, après mélange avec rnafixerIl se forme facilement un précipité insoluble.
5. Bactéries
Les bactéries ne se développent pas dans le rnafixer, mais le rnafixer ne détruit pas les bactéries, E. coli conserve un à 4 ° CL'ARN complet peut encore être proposé pendant un mois.
Dépôt des échantillons dans rnafixer:
1. Stocker à - 80 ℃Les échantillons sont conservés à long terme. Placez l'échantillon dans RNA fixer à 4 ℃ pendant la nuit, puis repérez l'échantillon, essayezLe liquide rnafixer propre est éliminé puis placé à - 80°c. Pour les cellules de culture tissulaire, l'élimination n'est pas nécessaireRNAfixer， La congélation directe à - 80 ° C ne lyse pas les cellules. L'échantillon peut fondre à température ambiante lorsqu'il est utilisé etIl est également possible de congeler à nouveau sans affecter l'intégrité et le rendement de l'ARN.
2. Stocker à - 20 ℃Les échantillons de rnafixer sont placés à 4°C pendant une nuit puis transférés à - 20°C. L'échantillon à - 20 ℃ n'est pas glacéCongelé, mais peut former quelques Cristaux, qui n'affectent pas l'extraction future de l'ARN. L'échantillon peut être dans la Chambre lorsqu'il est utiliséLa température fond et peut également être congelée à nouveau sans affecter l'intégrité et le rendement de l'ARN.
3. Stocker à 4 ℃Les échantillons peuvent être conservés à 4 ° C pendant un mois.
4. Stocké à 25 ℃L'ARN déposé sur l'échantillon à 25°C reste intact pendant une semaine et l'ARN de l'échantillon conservé pendant deux semaines présente une légère dégradation,Peut être utilisé pour l'analyse nordique, mais la qualité est suffisante pour la protection nuclease Assay ou RT - PCR.
5. Stocké à 37 ℃L'ARN déposé à 37°c est resté intact pendant 24 heures, avec une dégradation partielle au bout de 3 jours.Rnafixer préserve l'extraction de l'ARN de l'échantillon:Retirez l'échantillon du rnafixer, qui peut être versé directement dans la piscine, rincé à l'eau du robinet, pas besoinTraitement spécial.
1. Organisation
Extraire l'échantillon du rnafixer à l'aide d'une pince propre, après avoir légèrement aspiré le rnafixer résiduel à l'aide d'un papier absorbant,L'extraction de l'ARN peut être effectuée comme pour les tissus frais, selon la procédure standard de broyage à l'azote liquide suivi d'un traitement d'homogénat.
2. Cellules
Il existe deux options pour les cellules stockées dans rnafixer. L'un est d'extraire l'ARN après l'élimination du rnafixer, l'autreL'un est extrait directement d'un mélange de cellules et de rnafixer.
1) extraction de l'ARN après élimination du rnafixerLes cellules stockées dans le rnafixer deviennent moins fragiles et peuvent résister à des vitesses de centrifugation plus élevées sans se fissurerSolution. Nous avons l'expérience de la collecte réussie des cellules par centrifugation à 5000g, et comme chaque cellule n'est pas la même force, il est possible deFaites d'abord un pré - test avec des cellules sans importance pour garantir que la centrifugation à la vitesse d'utilisation ne détruira pas les cellules. Autre choixLe choix est de diluer le mélange de rnafixer et de cellules avec un volume égal de PBS avant centrifugation afin de réduire la densité de la solution,Permet à la solution cellulaire de précipiter.
2) Aucun rnafixer n'est enlevé, l'ARN est extrait directement
Il est également possible d'ajouter directement 10 fois le volume de réactifs d'extraction en une étape (par exemple, tripure, tri Reagent) aux cellules etUn mélange de rnafixer, puis suivez les étapes normales.

la PCRÉtapes de base et précautions?

I. principes expérimentaux

la PCREst une amplification sélective artificielle in vitroADNUne méthode qui ressemble à l'intérieur de l'organismeADNLa copie. Dans l'organismeADNLa copie nécessite des modèles, des amorces,ADNPolymérase,ADNHélicase,dNTP; et in vitrola PCRLa réaction nécessite également des ingrédients similaires, avec des modèles, des amorces,tampon PCREt,TaqEnzymes,dNTP. où les amorces sont des séquences spécifiques conçues artificiellement qui permettent l'amplification d'un emplacement particulier;tampon PCRFournir un environnement tampon pour la réaction; Le processus de réaction est le même que dans l'organisme,ADNLa double chaîne s'ouvre, les amorces se lient au gabarit et s'étendent pour former une nouvelle chaîne. Et ces processus reposent dans l'organismeADNL'enzyme dissout la chaîne, tandis qu'in vitro elle est obtenue en contrôlant la température de la réaction. Comme couramment utilisé94℃Modèle de dénaturationADNOuverture de la double chaîne, collage des amorces sur le gabarit à la température de recuit et enfin72℃Terminez l'extension et répétez ce processus encore et encore pour obtenir un fragment spécifiqueADNAmplification massive. Ne pas produire et cibler avant le début du troisième cycleADNSection identiqueADNMolécules, produisant plus cycliquement la cibleADNL'indice du segment est doublé.

Dans la phase ultérieure d'amplification,En raison de l'accumulation de produits,Rend la réaction initialement amplifiée exponentiellement une courbe plate,Le produit ne monte plus sensiblement avec le nombre de cycles,C’est ce qu’on appelle l’effet plateforme. Période de la plateforme(Plateau)Il permettra à de faibles concentrations de produits non spécifiques initialement produits à la suite d'une mésappariement de continuer l'amplification massive à des niveaux plus élevés. Par conséquent, le nombre de cycles doit être ajusté de manière appropriée, la réaction doit être terminée avant la période de plateau et les produits non spécifiques doivent être réduits. Arrivée à la période de plateforme(Plateau)Le nombre de cycles requis dépend de la copie du modèle dans l'échantillon.

II. Principaux ingrédients

1.Les modèles peuvent être de nombreuses formes, y compris principalement le génomeADN, plasmidesADNLe génome porteur du virusADNEt,la PCRProduits,ADNcAttendez, mais pas pourARN.Pour les différents types de modèles, la principale différence réside dans le temps de pré - dénaturation et dans la quantité de modèles. Généralement pour les grands génomesADNTemps de pré - dénaturation10 minutesSuffisant, plasmideADNA2minLe génome porteur du virusADNPré - dénaturation2 minutesEt,la PCRPré - dénaturation du produit2 minutesC'est bon.

AttentionADNcPour une seule chaîneADNMais peut encore être faitla PCRLe modèle, cependant, au premier tour de cycle, il n'y a qu'une seule amorce combinée, synthétisant une autre chaîne. Dès le deuxième tour, les deux amorces sont liées à un point ectopique, ce qui permet d'obtenir une liaison avec la routinela PCRDe convergence. Comme une seule chaîne.ARNMais ne peut pas être effectuéela PCRAmplification, la raison réside dans la réalisationla PCRLa réaction estADNPolymérase, qui ne peut être reconnue que de manière intentionnelleADNLa chaîne.

2.Pour la quantité de modèle, en général25ulLe systèmeADNLa qualité est50100ng. pour le génomeADNEn raison de sa structure plus complexe, la concentration extraite a également tendance à être plus grande, afin d'éviter les concentrations excessivesla PCRProvoque des effets, il est donc nécessaire d'extraireADNEffectuer une dilution en gradient. Sinon, une concentration trop élevée peut provoquer une amplification non spécifique. Pour les plasmides etla PCRLe produit n'a pas besoin d'être dilué en raison de sa structure simple et de la faible concentration d'extraction en général.

Produits vendus par la société:

la PCRQuels sont les problèmes à surveiller dans les expériences- Oui?

pas deCTValeur

Résultats de détection rencontré aucunCtSituation des valeurs,Vérifier s'il y a des problèmes avecPour:

1Pas assez de cycles(Généralement pas plus45cycle,Non seulement la valeur de fond augmente,Quantitativement pas non plus);

2Et,la PCRErreur de configuration du programme,L'étape de détection du signal de fluorescence est erronée. généralSGAdoption de la loi72℃Acquisition en extensionTaqManLa loi acquiert généralement le signal en fin de recuit ou en extension,Autre acquisition de fluorescence sélectionnée;

3Dégradation des amorces ou des sondes. Peut être passéPAGEDétection par électrophorèse si les amorces et sondes se dégradent;

4La quantité de gabarit peut être dégradée ou insuffisante(Pas plus de500ng,Selon les instructions du kit est OK),Les échantillons de concentration inconnue doivent commencer à la concentration la plus élevée des échantillons dilués de la série;Si la dégradation du modèle se produit,L'introduction d'impuretés dans la préparation de l'échantillon et la congélation et la dégel répétées doivent être prises en compte,Il est recommandé d'installer des échantillons de modèle en petites quantités en réserve,Évitez le gel - dégel répété;

5, si la sonde d'amorce est appropriée(En particulier, les amorces traversent les INTRONS,Pour assurer l'amplification du génomeADN;Amorces amont et avalTmValeur supérieure à4℃Ce qui précède affecte également l'amplification) et- Oui.

CTValeur trop tard

En quantification relative, CtValeurs généralement contrôlées en1525Mieux entre,Si dans la quantification absolue,Échantillons à faible nombre de copiesde CtLa valeur augmente,Mais en général, il ne faut pas dépasser40cycle,Sinon, la quantification est inexacte.

donc,JugementCtEst - ce que la valeur apparaît trop tard est une situation anormale,Cela doit être fait en fonction de la conception et du but de l'expérience spécifique.

1Faible efficacité d'amplification. Entre les amorces ou dans des proportions inappropriées entre les amorces et la sonde,Optimisation nécessaire;Conception déraisonnable des amorces ou des sondes,Nécessité de redessiner;

2Et,la PCRProgramme inapproprié,Passer à la méthode en trois étapes pour réagir,Ou optimiser le recuit/Température d'extension,La température de recuit peut être réduite de manière appropriée;Recuit/Temps d'extension court(Peut être prolongé dans les conditions de temps recommandées10s);

3Et,MgCl2Concentration inappropriée,Augmenter la concentration en ions magnésium, etc.la PCRDégradation ou insuffisance des différents Constituents réactionnels;

4Et,la PCRLe produit est trop long.la PCRConception du produit plus de500 pb;

5Présence d'inhibiteurs dans le modèle. Réalisé avec un modèle de haute puretéla PCRDétecter ou diluer le modèle.