Trzol LS (réactif d'extraction d'ARN pour échantillons liquides)

Propriétés de la marchandise:

Conditions de stockage:

Trzol LS est stable jusqu'à 12 mois à température ambiante. Néanmoins, pour de meilleurs résultats, nous vous recommandons de le conserver entre 2 et 8°c.

Conseils importants:

Les substances toxiques peuvent causer des brûlures en touchant la peau ou en les avalant par inadvertance. Lavez - le immédiatement après le contact avec la peau avec beaucoup de détergent et d'eau claire. En cas d'inconfort, consultez votre médecin et Recherchez le traitement approprié avec d'autres ingrédients.

Introduction du produit:

Les réactifs trzol ls sont des réactifs qui extraient l'ARN total directement des cellules ou des tissus. Il maintient l'intégrité de l'ARN lors de la fragmentation et de la lyse des cellules. Après addition de chloroforme, centrifugation, l'échantillon est divisé en une couche aqueuse, une couche intermédiaire et une couche organique. L'ARN est présent dans la couche aqueuse. Après collecte de la couche aqueuse ci - dessus, l'ARN peut être récupéré par précipitation dans l'isopropanol. Qu'il s'agisse d'êtres humains, d'animaux, de plantes ou de bactéries, cette méthode permet une meilleure séparation des tissus et des cellules en petites et grandes quantités. La simplicité de fonctionnement du réactif trzol LS permet de

Traiter plusieurs échantillons. Toutes les opérations peuvent être effectuées en une heure. L'ARN total extrait par trzol est capable d'éviter la contamination de l'ADN et des protéines et peut être utilisé pour l'analyse par transfert d'ARN, l'hybridation spot, le criblage Poly (A) +, la traduction in vitro, l'analyse de protection RNase et le clonage moléculaire. Si c'est pour la PCR, il est recommandé de traiter l'ARN total extrait avec de la DNase I au niveau de l'amplification lorsque les deux amorces sont à l'intérieur d'un seul exon.

Précautions:

1. Séparer l'échantillon d'ARN d'une petite quantité de tissu (1 ~ 10 mg) ou de cellules (10 2 - 10 4): ajouter 800 µl de trzol au tissu ou à la cellule. Après lyse de l'échantillon à soumettre, on ajoute du chloroforme et on effectue l'opération de soutirage de l'étape 2. Avant de précipiter l'ARN avec de l'isopropanol, ajouter 5 ~ 10 μg de Glycogen sans RNase comme vecteur de la couche d'échantillon d'eau. Pour réduire sa viscosité, aspirer deux fois avec la seringue 26 avant d'ajouter du chloroforme pour couper l'ADN génomique. Glycogen reste dans l'échantillon d'eau et co - analyse avec l'ARN. Il n'inhibe pas la synthèse de la première chaîne de la réaction de transcription inverse avant concentration à 4 mg / ML, ni la PCR.

Les échantillons peuvent être conservés à - 60 ° C ou - 70 ° C pendant au moins un mois après l'homogénation et avant l'ajout de chloroforme. La dissolution du précipité d'ARN dans l'éthanol à 75% peut être conservée pendant au moins une semaine à 2 - 8°c et pendant au moins un an à - 5 - 20°C.

Portez des gants et un masque oculaire lors du retrait de l'ARN avec trzol LS. Évitez tout contact avec la peau et les vêtements. Terminer l'opération dans le placard de ventilation chimique. Évitez l'inhalation respiratoire. Sans exception, la température ambiante est maintenue à 15 ~ 30 ℃.

Réactifs autonomes:

Chloroforme, alcool isopropylique, éthanol à 75% (formulé avec de l'eau RNase - free), eau RNase - Free (l'eau est ajoutée dans un flacon en verre sans RNase, le DEPC est ajouté à 0,1% (V / v). Laisser pendant la nuit et autoclaver). Solution SDS à 0,5% (formule RNase - eau libre) (facultatif).

Étapes opérationnelles:

A. Liquide biologique ajouter 0,75 ml de trzol LS par 0,25 ml d'échantillon liquide (sérum, plasma, etc.) et souffler l'échantillon liquide plusieurs fois avec un pistolet d'addition pour aider à lyser les cellules de l'échantillon. Ajouter au moins 0,75 ml de trzol LS pour 5 ~ 10 × 10 6 cellules. Pour les échantillons contenant des contaminants élevés, tels que les échantillons de sang total, l'extraction peut commencer après avoir été diluée deux fois avec de l'eau stérilisée dans un rapport de 1: 1. Le rapport de volume final entre trzol LS et l'échantillon liquide est toujours de 3: 1. B. les tissus sont agités avec du verre ou un homogénateur puissant, ajouter 0,75 ml de trzol LS pour 50 ~ 100 mg de tissu ou 0,25 ml de suspension tissulaire. Généralement, le volume de tissu de 50 à 100 mg doit être inférieur à 0,25 ML, si le volume de l'échantillon de tissu est inférieur à 0,25 ML, ajouter de l'eau stérilisée pour ajuster le volume de l'échantillon de tissu à 0,25 ML pour garantir un rapport de volume de 3: 1. C. cellules cultivées en monocouche ajouter 0,3 ml - 0,4 ml de cellules lysées trzol LS directement dans une plaque de culture de 3,5 cm de diamètre, souffler avec un pistolet d'addition pour aider à lyser adéquatement les cellules. La quantité de trzol LS nécessaire est déterminée en fonction de la surface de la plaque de culture plutôt que du nombre de cellules (plus 0,3 - 0,4 ML pour 10 cm 2). Il n'est pas nécessaire d'ajouter de l'eau au lysat, car le trzol LS a été suffisamment dilué par le liquide de culture restant fixé dans la plaque de culture. D. les cellules cultivées en suspension sont précipitées par centrifugation. Soufflage répété des cellules lysées par pipette dans le réactif trzol LS. Chaque 5 ~ 10 × 10 6 cellules animales, végétales ou cellules de levure ou chaque 1 × 10 7 bactéries plus 0,75 ml de trzol LS. Le volume de l'échantillon est ajusté à 0,25 ML avec de l'eau stérilisée comme à l'étape B. le lavage des cellules doit être évité avant l'ajout de trzol LS, car cela augmente la probabilité de dégradation de l'ARNm. La rupture de certaines levures et bactéries peut nécessiter l'utilisation d'homogénateurs. 2. L'étape de séparation incube l'échantillon d'homogénat à 15 - 30°C pendant 5 min pour permettre la décomposition des nucléosomes. Ajouter 0,2 ml de chloroforme pour 0,75 ml de trzol LS. Fermer le couvercle du tube d'échantillon, agiter vigoureusement le tube à la main pendant 15 secondes et l'incuber à température ambiante pendant 2 à 15 minutes. Cryocentrifugation à grande vitesse avec une force centrifuge ne dépassant pas 12 000 × G à 2 ~ 8 ° C pendant 15 min. Après centrifugation, le mélange est divisé en trois couches: une couche inférieure - une couche de chloroforme, une couche intermédiaire et une couche supérieure d'échantillon d'eau incolore. L'ARN est présent dans la couche aqueuse sans exception. La capacité de la couche d'échantillon d'eau est d'environ 70% de la capacité de trzol LS ajoutée.

2. La précipitation de l'ARN transfère la couche d'échantillon d'eau dans un tube à essai propre, et si l'on souhaite séparer l'ADN et la protéine, la couche organique et la couche intermédiaire sont également conservées. L'ARN est précipité par mélange de la couche aqueuse et de l'isopropanol. Chaque 0,75 ml de trzol LS correspond à 0,5 ml d'isopropanol. Les échantillons mélangés sont incubés à 15 - 30 ° C pendant 10 min et cryocentrifugés à haute vitesse à une force centrifuge ne dépassant pas 12 000 × G à 2 ~ 8 ° C pendant 10 min. Les précipités d'ARN ne sont généralement pas visibles avant la centrifugation, après quoi il se forme un précipité gélatineux en forme de feuille qui se fixe à la paroi et au fond du tube.

3. Le rinçage de l'ARN élimine la suspension supérieure. Le précipité d'ARN est lavé une fois avec de l'éthanol à 75% (formulé avec de l'eau RNase - free) en ajoutant au moins 1 mL d'éthanol à 75% pour 0,75 ml de trzol LS. Les échantillons sont mélangés par oscillation de vortex et cryocentrifugés à haute vitesse à une force centrifuge ne dépassant pas 7500 × g pendant 5 min à 2 ~ 8 ° c.

4. Redissolution de l'ARN température ambiante simple précipitation sèche de l'ARN, ne pas centrifuger l'ARN sec dans un tube à vide. Il est particulièrement important de ne pas laisser sécher le précipité d'ARN, ce qui réduit considérablement sa solubilité. Les échantillons d'ARN partiellement dissous ont un rapport od260 / od280 < 1,6. Une solution de RNase - Free Water ou de SDS à 0,5% (formulé avec de l'eau RNase - free) est pipettée plusieurs fois pour dissoudre l'ARN (évitez d'utiliser du SDS si l'ARN doit être utilisé plus tard dans une réaction de clivage enzymatique). L'ARN est également redissous par du Formamide à 100% (élimination des ions) et conservé à - 70°c.

Étapes et précautions de base de la PCR?

I. principes expérimentaux

La PCR est une méthode d'amplification sélective artificielle de l'ADN in vitro qui ressemble à la réplication de l'ADN dans un organisme. La réplication de l'ADN dans l'organisme nécessite des matrices, des amorces, des ADN polymérases, des ADN hélicases, des dNTP; La réaction de PCR in vitro nécessite également des composants similaires, avec des modèles, des amorces, des Buffers PCR, des enzymes Taq, dNTPs。 Où les amorces sont des séquences spécifiques conçues artificiellement, permettant l'amplification de positions spécifiques; Le buffer PCR fournit un environnement tampon pour la réaction; Le processus de réaction est le même que dans l'organisme, le double brin d'ADN s'ouvre et les amorces se lient au gabarit pour former de nouveaux brins. Ces processus sont réalisés dans l'organisme par l'ADN - Hélicase, et in vitro par le contrôle de la température de la réaction. La dénaturation de l'ADN modèle à 94 ° C pour ouvrir le double brin, la fixation des amorces sur le modèle à la température de recuit, et enfin l'extension complète à 72 ° C, et la répétition répétée de ce processus permet une amplification massive d'un fragment particulier d'ADN. Ce n'est qu'au début du troisième cycle que des molécules d'ADN identiques au segment d'ADN cible sont produites, ce qui produit cycliquement un doublement exponentiel du segment d'ADN cible.

Plus tard dans l'amplification, en raison de l'accumulation du produit, la réaction qui était initialement amplifiée exponentiellement devient une courbe plate et le produit ne monte plus significativement avec le nombre de cycles, ce qui est connu sous le nom d'effet de plate - forme. La phase de plateau permet à de faibles concentrations de produits non spécifiques, initialement dues à des mésappariements, de continuer à s'amplifier à des niveaux élevés. Par conséquent, le nombre de cycles doit être ajusté de manière appropriée, la réaction doit être terminée avant la période de plateau et les produits non spécifiques doivent être réduits. Le nombre de cycles nécessaires pour atteindre la période de la plate - forme dépend de la copie du modèle dans l'échantillon.

II. Principaux ingrédients

1. Le modèle peut être de nombreuses formes, principalement l'ADN génomique, l'ADN plasmidique, l'ADN génomique porteur du virus, les produits de PCR, l'adnc, etc., mais pas l'ARN. Pour les différents types de modèles, la principale différence réside dans le temps de pré - dénaturation ainsi que dans la quantité de modèles. En général, un temps de dénaturation de l'ADN génomique de 10 min est suffisant, le plasmide dna2min, l'ADN génomique porteur du virus 2 min, le produit de PCR 2 min suffisent.

Notez que l'adnc est de l'ADN simple brin, mais vous pouvez toujours faire le modèle de PCR, sauf qu'une seule amorce se lie au premier cycle pour synthétiser l'autre brin. Dès le deuxième tour, les deux amorces se lient à des sites ectopiques spécifiques, permettant ainsi une convergence avec la PCR conventionnelle. L'ARN en tant que simple brin ne peut pas être amplifié par PCR, car la réaction de PCR est réalisée par l'ADN polymérase, qui ne peut que reconnaître délibérément le brin d'ADN.

2. Pour la quantité de pochoir, la masse générale de l'ADN système de 25 µl est de 50 100 ng. pour l'ADN génomique en raison de sa structure relativement complexe, la concentration extraite a également tendance à être relativement élevée, afin d'éviter que la concentration excessive n'affecte la PCR, il est nécessaire d'effectuer une dilution gradient de l'ADN extrait. Sinon, une concentration trop élevée peut provoquer une amplification non spécifique. Aucune dilution n'est nécessaire pour les plasmides et les produits PCR en raison de leur structure simple et des concentrations d'extraction généralement faibles.

Quels sont les problèmes à surveiller dans une expérience de PCR?

Pas de valeur CT

Les résultats de la détection ont rencontré aucune valeur de CT et ont vérifié s'il y avait les problèmes suivants:

1, le nombre de cycles n'est pas suffisant (généralement pas plus de 45 cycles, non seulement la valeur de fond s'améliore, mais la quantité n'est pas suffisante);

2, mauvaise configuration du programme PCR, erreur dans l'étape de détection du signal Fluorescent. La méthode générale SG utilise 72 ℃ d'acquisition à l'extension, la loi Taqman acquiert généralement le signal à la fin du recuit ou à l'extension, l'acquisition de fluorescence supplémentaire est sélectionnée ou non;

3, dégradation des amorces ou des sondes. La dégradation des amorces et des sondes peut être détectée par électrophorèse page;

4, la taille du gabarit peut être dégradée ou la quantité d'échantillon inférieure (pas plus de 500 ng, selon les instructions du kit est OK), pour les échantillons de concentration inconnue doit commencer par la concentration la plus élevée de la série d'échantillons dilués; Si la dégradation du coffrage se produit, il faut tenir compte de l'introduction d'impuretés dans la préparation de l'échantillon et des cas de gel et de dégel répétés, il est recommandé de stocker les échantillons de coffrage en petites quantités pour éviter le gel et la dégel répétés;

Si la sonde d'amorce est appropriée (en particulier si l'amorce traverse l'intron pour assurer l'amplification de l'ADN génomique); Des valeurs supérieures à 4°C des amorces amont et aval TM affectent également l'amplification).

Valeur CT trop tard

Dans la quantification relative, la valeur de CT est généralement contrôlée entre 1525, si dans la quantification absolue, pour les échantillons à faible nombre de copies, la valeur de CT augmentera, mais généralement pas plus de 40 cycles, sinon la quantification est inexacte.

Par conséquent, il est anormal de juger si la valeur de CT apparaît trop tard et doit être effectuée en fonction de la conception et du but de l'expérience spécifique.

1, faible efficacité d'amplification. Les proportions entre amorces ou entre amorces et sondes ne sont pas appropriées et doivent être optimisées; La conception de l'amorce ou de la sonde n'est pas raisonnable et nécessite une refonte;

2, la procédure PCR n'est pas appropriée, utilisez la méthode en trois étapes pour la réaction ou optimisez la température de recuit / extension, vous pouvez réduire la température de recuit de manière appropriée; Le recuit / allongement est court (il peut être prolongé de 10 s dans les conditions de temps recommandées);

3, la concentration de MgCl2 n'est pas appropriée, augmente la concentration d'ions magnésium, etc. Une dégradation ou un dosage insuffisant des différents Constituents réactifs de la PCR;

Les produits PCR sont trop longs. Conception de produits PCR supérieure à 500 pb;

5, inhibiteurs présents dans le modèle. Détection PCR avec un gabarit de haute pureté ou dilution du gabarit.

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