Kit d'extraction rapide ADN / ARN génomique viral

Propriétés de la marchandise:

la PCRÉtapes de base et précautions?

I. principes expérimentaux

la PCREst une amplification sélective artificielle in vitroADNUne méthode qui ressemble à l'intérieur de l'organismeADNLa copie. Dans l'organismeADNLa copie nécessite des modèles, des amorces,ADNPolymérase,ADNHélicase,dNTP; et in vitrola PCRLa réaction nécessite également des ingrédients similaires, avec des modèles, des amorces,tampon PCREt,TaqEnzymes,dNTP. où les amorces sont des séquences spécifiques conçues artificiellement qui permettent l'amplification d'un emplacement particulier;tampon PCRFournir un environnement tampon pour la réaction; Le processus de réaction est le même que dans l'organisme,ADNLa double chaîne s'ouvre, les amorces se lient au gabarit et s'étendent pour former une nouvelle chaîne. Et ces processus reposent dans l'organismeADNL'enzyme dissout la chaîne, tandis qu'in vitro elle est obtenue en contrôlant la température de la réaction. Comme couramment utilisé94℃Modèle de dénaturationADNOuverture de la double chaîne, collage des amorces sur le gabarit à la température de recuit et enfin72℃Terminez l'extension et répétez ce processus encore et encore pour obtenir un fragment spécifiqueADNAmplification massive. Ne pas produire et cibler avant le début du troisième cycleADNSection identiqueADNMolécules, produisant plus cycliquement la cibleADNL'indice du segment est doublé.

Dans la phase ultérieure d'amplification,En raison de l'accumulation de produits,Rend la réaction initialement amplifiée exponentiellement une courbe plate,Le produit ne monte plus sensiblement avec le nombre de cycles,C’est ce qu’on appelle l’effet plateforme. Période de la plateforme(Plateau)Il permettra à de faibles concentrations de produits non spécifiques initialement produits à la suite d'une mésappariement de continuer l'amplification massive à des niveaux plus élevés. Par conséquent, le nombre de cycles doit être ajusté de manière appropriée, la réaction doit être terminée avant la période de plateau et les produits non spécifiques doivent être réduits. Arrivée à la période de plateforme(Plateau)Le nombre de cycles requis dépend de la copie du modèle dans l'échantillon.

II. Principaux ingrédients

1.Les modèles peuvent être de nombreuses formes, y compris principalement le génomeADN, plasmidesADNLe génome porteur du virusADNEt,la PCRProduits,ADNcAttendez, mais pas pourARN.Pour les différents types de modèles, la principale différence réside dans le temps de pré - dénaturation et dans la quantité de modèles. Généralement pour les grands génomesADNTemps de pré - dénaturation10 minutesSuffisant, plasmideADNA2minLe génome porteur du virusADNPré - dénaturation2 minutesEt,la PCRPré - dénaturation du produit2 minutesC'est bon.

AttentionADNcPour une seule chaîneADNMais peut encore être faitla PCRLe modèle, cependant, au premier tour de cycle, il n'y a qu'une seule amorce combinée, synthétisant une autre chaîne. Dès le deuxième tour, les deux amorces sont liées à un point ectopique, ce qui permet d'obtenir une liaison avec la routinela PCRDe convergence. Comme une seule chaîne.ARNMais ne peut pas être effectuéela PCRAmplification, la raison réside dans la réalisationla PCRLa réaction estADNPolymérase, qui ne peut être reconnue que de manière intentionnelleADNLa chaîne.

2.Pour la quantité de modèle, en général25ulLe systèmeADNLa qualité est50100ng. pour le génomeADNEn raison de sa structure plus complexe, la concentration extraite a également tendance à être plus grande, afin d'éviter les concentrations excessivesla PCRProvoque des effets, il est donc nécessaire d'extraireADNEffectuer une dilution en gradient. Sinon, une concentration trop élevée peut provoquer une amplification non spécifique. Pour les plasmides etla PCRLe produit n'a pas besoin d'être dilué en raison de sa structure simple et de la faible concentration d'extraction en général.

la PCRQuels sont les problèmes à surveiller dans les expériences- Oui?

pas deCTValeur

Résultats de détection rencontré aucunCtSituation des valeurs,Vérifier s'il y a des problèmes avecPour:

1Pas assez de cycles(Généralement pas plus45cycle,Non seulement la valeur de fond augmente,Quantitativement pas non plus);

2Et,la PCRErreur de configuration du programme,L'étape de détection du signal de fluorescence est erronée. généralSGAdoption de la loi72℃Acquisition en extensionTaqManLa loi acquiert généralement le signal en fin de recuit ou en extension,Autre acquisition de fluorescence sélectionnée;

3Dégradation des amorces ou des sondes. Peut être passéPAGEDétection par électrophorèse si les amorces et sondes se dégradent;

4La quantité de gabarit peut être dégradée ou insuffisante(Pas plus de500ng,Selon les instructions du kit est OK),Les échantillons de concentration inconnue doivent commencer à la concentration la plus élevée des échantillons dilués de la série;Si la dégradation du modèle se produit,L'introduction d'impuretés dans la préparation de l'échantillon et la congélation et la dégel répétées doivent être prises en compte,Il est recommandé d'installer des échantillons de modèle en petites quantités en réserve,Évitez le gel - dégel répété;

5, si la sonde d'amorce est appropriée(En particulier, les amorces traversent les INTRONS,Pour assurer l'amplification du génomeADN;Amorces amont et avalTmValeur supérieure à4℃Ce qui précède affecte également l'amplification) et- Oui.

CTValeur trop tard

En quantification relative, CtValeurs généralement contrôlées en1525Mieux entre,Si dans la quantification absolue,Échantillons à faible nombre de copiesde CtLa valeur augmente,Mais en général, il ne faut pas dépasser40cycle,Sinon, la quantification est inexacte.

donc,JugementCtEst - ce que la valeur apparaît trop tard est une situation anormale,Cela doit être fait en fonction de la conception et du but de l'expérience spécifique.

1Faible efficacité d'amplification. Entre les amorces ou dans des proportions inappropriées entre les amorces et la sonde,Optimisation nécessaire;Conception déraisonnable des amorces ou des sondes,Nécessité de redessiner;

2Et,la PCRProgramme inapproprié,Passer à la méthode en trois étapes pour réagir,Ou optimiser le recuit/Température d'extension,La température de recuit peut être réduite de manière appropriée;Recuit/Temps d'extension court(Peut être prolongé dans les conditions de temps recommandées10s);

3Et,MgCl2Concentration inappropriée,Augmenter la concentration en ions magnésium, etc.la PCRDégradation ou insuffisance des différents Constituents réactionnels;

4Et,la PCRLe produit est trop long.la PCRConception du produit plus de500 pb;

5Présence d'inhibiteurs dans le modèle. Réalisé avec un modèle de haute puretéla PCRDétecter ou diluer le modèle.

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