AminobillineN-N-Déméthylase (ET) etDescription du kit de détermination de l'activité

Méthode des traces 100 Tubes/ 48 L'échantillon

Toujours prendre avant la détermination officielle 2 - 3 Un échantillon avec de grandes différences attendues fait des prédictionsDétermination de la signification:

CytochromesP450 Les enzymes sont un groupe de lignées enzymatiques qui jouent un rôle important dans le métabolisme des substances exogènes, en particulier les médicaments et les poisons.ET commeP450Un membre important de la lignée enzymatique, équivalent àCYP3A4 Sous - type, étroitement lié à la réaction de déméthylation du médicament.

Principe de détermination:

ET Libération catalytique de formaldéhyde par l'aminobirine, par Nash Détermination colorimétrique de la teneur en formaldéhyde, prêt à calculersortir ET Activité.

Kit de dosage de l'activité aminobilin - N - déméthylase P450

Composition:

Réactif 1: poudre× 1 Les bouteilles,4℃Préserver. Avant utilisation plus 100 ml L'eau distillée se dissout suffisamment.

Réactif III: poudre× 1 Le tube,4℃Conserver à l'abri de la lumière. Adhérer avant utilisation 1 ml éthanol anhydre, bien dissous. Réactif IV: poudre× 1Le tube,4℃Préserver. Adhérer avant utilisation 0,5 mlEau distillée, bien dissoute.

Réactif V: poudre× 1 Bouteille, conserver à température ambiante. Eau distillée avant utilisation 4 ml Suffisamment dissous.

Liquide Standard: liquide× 1 Les bouteilles,-20℃Préserver. Prendre avant utilisation 1,5 ml EP Tube, rejoindre 10 μl Liquide standard, plus 990 μl Eau distillée, le mélange est0.05 mmol/L Solution standard de Jia - aldéhyde,4℃Préserver.

Les paramètres du produit spécifique sont soumis aux paramètres de la description du produit reçu

Instruments et fournitures propres:

Centrifugeuse ordinaire, centrifugeuse ultra - rapide, bain - Marie, pistolet à pipette réglable, Spectrophotomètre UV/Marqueur enzymatique, cuvette colorimétrique à traces de quartz/ 96 trouPlaque, eau distillée, éthanol anhydre et glace.

Extraction enzymatique brutePour:

1、Élimination des noyaux cellulaires, des mitochondries et autres substances macromoléculaires:Appeler environ 0.5g Organisation, adhérer 1 ml Réactif un, bien broyé sur la glace,10 000g 4℃Loin deCœur 30 minutesPrélever le surnageant dans le tube d'ultracentrifugation.

2、Microsomes bruts:4℃,100 000g, centrifugation 60 minutesJeter le surnageant.

3élimination des impuretés telles que l'hémoglobine: vers l'étape 2 Addition au précipité 1 ml Réactif un, après le couvercle serré bien commotionné dissous,100 000g Centrifugation 30 minutes, abandonnerLe surnageant.

4、Microsomes finaux:Vers les étapes 3 Précipitation du réactif II 0.5 ml, couvercle serré après une dissolution suffisante de commotion, c'est - à - dire le liquide enzymatique brut, à mesurer. Ce besoin de liquide à mesurer

Utilisé le jour même.

ET Opérations de détermination de l'activité:

1. Spectrophotomètre/Préchauffage de l'étalon enzymatique 30 min, régule la longueur d'onde à 412 nmL'eau distillée est mise à zéro.

2. Réactif deux placé 37℃Préchauffage au bain - Marie 30 minutes- Oui.

3. Aux soins:取 1 brancheEP Tube, rejoindre 10 μl Liquide enzymatique brut,170 μl Réactif deux,10 μl Réactif trois,10 μl Eau distillée, après mélange placée 37℃

Isolation du bain d'eau 30 minutes; adhérer maintenant 35 μl Réactif cinq, après mélange placé dans un bain de glace 5 minutes；取sortirAdhérer après 35 μl Réactif six, température ambiante après mélangeLaisser reposer 5 minutes; température ambiante 8000rpm Centrifugation 5 minutes; prendre le nouveauEP Tube, rejoindre 100 μl Le surnageant,100 μl Réactif sept, après mélange 60℃Bain d'eau 10 minutes, puis prendresortir, refroidi avec de l'eau froide 5 minutes, à 412 nmDétermination de l'absorption lumineuse, notéeAAux soins.

4. Tube de détermination:取 1 brancheEP Tube, rejoindre 10 μl Liquide enzymatique brut,170 μl Réactif deux,10 μl Réactif trois,10 μl Réactif quatre, après mélange placé 37℃

Isolation du bain d'eau 30 minutes; adhérer maintenant 35 μl Réactif cinq, après mélange placé dans un bain de glace 5 minutes；取sortirAdhérer après 35 μl Réactif six, température ambiante après mélangeLaisser reposer 5 minutes; température ambiante 8000rpm Centrifugation 5 minutes；取 1 Nouvelle brancheEP Tube, rejoindre 100 μl Le surnageant,100 μl Réactif sept, après mélange 60℃EauLe bain 10 minutes, puis prendresortir, refroidi avec de l'eau froide 5 minutes, à 412 nmDétermination de l'absorption lumineuse, notéeADéterminer le tube.

5. Tube Standard:取 1 brancheEP Tube, rejoindre 100 μl Standard,100 μl Réactif sept, après mélange 60℃Bain d'eau 10 minutes, puis prendresortirAvec le froidRefroidissement par eau5 minutes, à412 nm Détermination de l'absorption lumineuse, notéeA Tubes Standard.

Remarque: chaque échantillon doit être pris en charge.

ET Calcul de l'activité:

a.La formule de calcul pour la détermination à l'aide d'une boîte colorimétrique de quartz à l'état de traces est la suivante:

（1）Calculé par concentration en protéines

Définition des unités actives:37℃Production catalytique de protéines par milligramme par minute 1nmol Le formaldéhyde est 1 Une unité enzymatique vivante.

ET Activité(nmol/min/mg) prot) =C Produits standard×V Produits standard×(A Tube de détermination -A Soins aux) et÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(Cpr× VLe genre)÷T

=45 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷Cpr- Oui.

（2）Calculé par qualité d'échantillon

Définition des unités actives:37℃Production catalytique par gramme de tissu par minute 1nmol Le formaldéhyde est 1 Une unité enzymatique vivante.

ET Activité(nmol/min/g) Poids frais ) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(V) L'échantillon

÷V Total des échantillons× W) ÷ T

=45 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷W- Oui.

C Produits standard:0.05 mmol/L = 50 μmol/L;V Produits standard:500μl = 0,0005 L; multiples de dilution:V Anti - Total÷V Surnageant=（50 + 850

+ 50 + 50 + 175 + 175) et÷ 500 = 2,7;CPR: concentration en protéines du liquide enzymatique brut (mg/ml) et, nécessite une détermination supplémentaire, il est recommandé d'utiliser cette société BCAKit de détermination de la teneur en protéines;VÉchantillon: ajouter le volume de liquide enzymatique brut,50 μl = 0,05 ml;Véchantillon total: volume de liquide extrait,0,5 ml;T: temps de réaction catalytique (min),30 minutes- Oui.

b.utiliser 96 La formule de calcul pour la détermination de la plaque à trous est la suivante:

（1）Calculé par concentration en protéines

Définition des unités actives:37℃Production catalytique de protéines par milligramme par minute 1nmol Le formaldéhyde est 1 Une unité enzymatique vivante.

ET Activité(nmol/min/mg) prot) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Soins aux) et÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(Cpr× VLe genre)÷T

=45 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷CPR- Oui.

（2）Calculé par qualité d'échantillon

Définition des unités actives:37℃Production catalytique par gramme de tissu par minute 1nmol Le formaldéhyde est 1 Une unité enzymatique vivante.

ET Activité(nmol/min/g) Poids frais) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(V) L'échantillon÷VTotal des échantillons× W) ÷ T

=45 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷W- Oui.

C Produits standard:0.05 mmol/L = 50 μmol/L;V Produits standard:500μl = 0,0005 L; multiples de dilution:V Anti - Total÷V Surnageant=（50 + 850

+ 50 + 50 + 175 + 175) et÷ 500 = 2,7;CPR: concentration en protéines du liquide enzymatique brut (mg/ml) et, nécessite une détermination supplémentaire, il est recommandé d'utiliser cette société BCAKit de détermination de la teneur en protéines;V Échantillon: ajouter le volume de liquide enzymatique brut,50 μl = 0,05 ml;V échantillon total: volume de liquide extrait,0.5 ml;T: temps de réaction catalytique (min),30 minutes- Oui.

Précautions:

1Le liquide enzymatique brut doit être terminé le même jour pour le dosage, si nécessaire pour la conservation, puis l'étape d'extraction du liquide enzymatique brut 3 Addition au précipité 0,5 ml 20%Glycérine, après le fractionnement,

-80℃Conservation;

2, réactif trois et réactif quatre doivent être formulés avant utilisation, si le jour n'est pas utilisé,4℃Protégé de la lumière, disponible 1 Semaines;

3Liquide enzymatique brut peut être utilisé directement pour la détermination de la concentration en protéines, recommandé pour BCA La teneur en protéines est mesurée par méthode.

Kit de dosage de l'activité aminobilin - N - déméthylase P450