Aniline - 4 - hydroxylase (ah)Description du kit de détermination de l'activité

Méthode des traces 100 Tubes/ 48 L'échantillon

Toujours prendre avant la détermination officielle 2 - 3 Un échantillon avec de grandes différences attendues fait des prédictionsDétermination de la signification:

CytochromesP450 Les enzymes sont un groupe d'Isoenzymes présentes principalement dans le foie et jouent un rôle important dans le métabolisme des substances exogènes, en particulier les médicaments etMétabolisme des poisons.AH DansP450 Équivalent en lignée enzymatiqueCYP2E1 Sous - type,CYP2E1 Non seulement est impliqué dans le métabolisme du médicament, mais catalyse également plusieursProcessus d'activation des carcinogènes et des poisons prospécifiques.

Principe de détermination:

AH Produit après Hydroxylation catalytique de l'aniline 4 -Aminophénols, davantage transformés en Phénols-Complexe indolique, dans 630 nm Il y a un pic d'absorption caractéristique; ViaSur - détermination 630 nmTaux d'augmentation de l'Absorbance pour calculerAHActivité.

Kit de détermination de l'activité aniline - 4 - hydroxylase (ah)

Composition:

Réactif 1: poudre× 1 Les bouteilles,4℃Préserver. Adhérer avant utilisation 100 ml Eau distillée, bien dissoute. Réactif III: poudre× 1Les bouteilles,4℃Préserver. Adhérer avant utilisation 10 mlEau distillée, bien dissoute. Réactif IV: poudre× 1Les bouteilles,4℃Préserver. Adhérer avant utilisation 5 mlEau distillée, bien dissoute.

Réactif six: poudre× 1 Flacon (réactif corrosif),4℃Conserver à l'abri de la lumière. Adhérer avant utilisation 10 ml Eau distillée, bien dissoute. Réactif VII: poudre× 1Les bouteilles,4℃Préserver. Adhérer avant utilisation 10 mlL'eau distillée se dissout suffisamment.

Liquide Standard: liquide× 1 Les bouteilles,10 μmol/L,4℃Conserver à l'abri de la lumière.

Les paramètres du produit spécifique sont soumis aux paramètres de la description du produit reçu

Instruments et fournitures propres:

Centrifugeuse ordinaire, centrifugeuse ultra - rapide, spectrophotomètre visible/Étalonneur enzymatique, boîte colorimétrique en verre à l'état de traces/ 96 Plaque de puits, double vapeur d'eau et de glace.

Extraction du liquide enzymatique brut:

1、Élimination des noyaux cellulaires, des mitochondries et autres substances macromoléculaires:Appeler environ 0.5g Organisation, adhérer 1 ml Réactif un, bien broyé sur la glace,10 000g 4℃，Centrifugation 30 minutes, prenez le surnageant et Transférez - le dans le tube d'ultracentrifugation.

2、Microsomes bruts: 100 000g 4℃, centrifugation 60 minutesJeter le surnageant.

3、Élimination des impuretés telles que l'hémoglobine:Vers les étapes 2 Addition au précipité 1 ml Réactif un, après le couvercle serré bien commotionné dissous,100 000g Centrifugation 30 minutes, abandonner

Le surnageant.

4、Microsomes finaux:Vers les étapes 3 Précipitation du réactif II 0,5 ml, couvercle serré après une dissolution suffisante de commotion, c'est - à - dire le liquide enzymatique brut, à mesurer.

Opérations de déterminationPour:

1. Spectrophotomètre/Préchauffage de l'étalon enzymatique 30 min, régule la longueur d'onde à 630 nmL'eau distillée est mise à zéro.

2. Réactif trois placé 37℃Préchauffage au bain - Marie 30 minutes- Oui.

3. Réactif cinq placé dans un bain de glace pré - refroidi 30 minutes- Oui.

4. Tube Standard:取 0.5 ml EP Tube, rejoindre 100 μl Liquide standard,100 μl Réactif six,100 μl Réactif sept, laisser reposer à température ambiante après mélange 30 minutes，Sucer 200 μlEn verre micrométrique/ 96Plaque de trou,630 nmDétermination de l'absorption lumineuse, notéeATubes Standard.

5. Aux soins:取 0.5 ml EP Tube, rejoindre 50 μl Liquide enzymatique brut,100 μl Réactif trois,50 μl Eau distillée, après mélange 37℃Isolation au bain - Marie 30 minutes;

Adhérer à nouveau 100 μl Réactif cinq, bain de glace après mélange 5 minutes,11000rpm,4℃, centrifugation 10 minutes；取 100 μl Surnageant, ajouter un nouveau 0.5 mlEP Les tubes; Adhérer à nouveau 100 μl Réactif six,100 μl Réactif sept, laisser reposer à température ambiante après mélange 30 minutes, sucer 200 μl En verre micrométrique/ 96 trouLes plaques,630 nmDétermination de l'absorption lumineuse, notée AAux soins.

6. Tube de détermination:取 0.5 ml EP Tube, rejoindre 50 μl Liquide enzymatique brut,100 μl Réactif trois,50 μl Réactif quatre, après mélange 37℃Isolation au bain - Marie 30 minutes;

Adhérer à nouveau 100 μl Réactif cinq, bain de glace après mélange 5 minutes,11000rpm,4℃, centrifugation 10 minutes；取 100 μl Surnageant, ajouter un nouveau 0.5 mlEP Les tubes; Adhérer à nouveau 100 μl Réactif six,100 μl Réactif sept, laisser reposer à température ambiante après mélange 30 minutes, sucer 200 μl En verre micrométrique/ 96 trouLes plaques,630 nmDétermination de l'absorption lumineuse, notée ADéterminer le tube.

AH Formule de calcul de l'activitéPour:

a.La formule de calcul pour la détermination à l'aide d'une boîte colorimétrique de quartz à l'état de traces est la suivante:

（1）Calculé par concentration en protéines

Définition des unités actives:37℃Production catalytique par milligramme de protéine par minute 1nmol 4 -Les aminophénols sont 1 Une unité enzymatique vivante.

AH Activité(nmol/min/mg) prot) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(Cpr × VLe genre)÷T

=2 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷Cpr- Oui.

（2）Calculé par qualité d'échantillon

Définition des unités actives:37℃Production catalytique par minute pour chaque gramme d'échantillon 1nmol 4 -Les aminophénols sont 1 Une unité enzymatique vivante.

AHActivité(nmol/min/g) Poids frais) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Soins aux) et÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(W×V) L'échantillon÷T

=2 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷W

CProduits standard:10 μmol/L;VProduits standard:100 μl = 1 × 10^-4L; multiples de dilution: VAnti - Total÷VSurnageant= 300 μl ÷ 100 μl = 3;CPR: grossièreConcentration en protéines du liquide enzymatique (mg/ml) et, nécessite une détermination supplémentaire, il est recommandé d'utiliser cette société BCA Kit de détermination de la teneur en protéines;W : qualité de l'échantillon;VÉchantillon: volume de liquide enzymatique brut ajouté au système réactionnel, 50 μl = 0,05 ml; T: temps de réaction catalytique (min),30 minutes- Oui.

b.utiliser 96 La formule de calcul pour la détermination de la plaque à trous est la suivante:

（1）Calculé par concentration en protéines

Définition des unités actives:37℃Production catalytique par milligramme de protéine par minute 1nmol 4 -Les aminophénols sont 1 Une unité enzymatique vivante.

AH Activité(nmol/min/mg) prot) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(Cpr × VLe genre)÷T

=2 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷Cpr

（2）Calculé par qualité d'échantillon

Définition des unités actives:37℃Production catalytique par minute pour chaque gramme d'échantillon 1nmol 4 -Les aminophénols sont 1 Une unité enzymatique vivante.

AH Activité(nmol/min/g) Poids frais) =C Produits standard× V Produits standard×(A Tube de détermination -A Soins aux) et÷A Tubes Standard×Multiple de dilution÷(W×V) L'échantillon÷T

=2 ×(A Tube de détermination -A Aux soins)÷A Tubes Standard÷W

C Produits standard:10 μmol/L;V Produits standard:100 μl = 1 × 10^-4L; multiples de dilution:V Anti - Total÷VSurnageant= 300 μl ÷ 100 μl = 3;CPR: concentration en protéines du liquide enzymatique brut (mg/ml),Nécessite une détermination supplémentaire, il est recommandé d'utiliser cette société BCA Kit de détermination de la teneur en protéines; W : qualité de l'échantillon; VÉchantillon: volume de liquide enzymatique brut ajouté au système réactionnel, 50 μl = 0,05 ml; T: temps de réaction catalytique (min),30 minutes- Oui.

Kit de détermination de l'activité aniline - 4 - hydroxylase (ah)